核心提示：在溃疡性结肠炎(UC)患者中，发现P-gp表达减少与上皮衍生的抗炎内源性大麻素和管腔的含量(例如，微生物或其代谢物)的减少相关，从而降低了诱导P-gp表达的能力。

  摘要

  作者已经确定了肠道菌群的“功能核心”微生物群，特别是梭菌和杆菌类的属，这是小鼠模型肠道上皮中P-gp诱导的必要和充分的。该核心微生物群落的宏基因组分析显示，短链脂肪酸和二级胆红酸的产生与P-gp的表达呈正相关。进一步证明，这两类微生物衍生代谢物在体外和体内协同上调P-gp的表达和功能。此外，在溃疡性结肠炎(UC)患者中，发现P-gp表达减少与上皮衍生的抗炎内源性大麻素和管腔的含量(例如，微生物或其代谢物)的减少相关，从而降低了诱导P-gp表达的能力。

  结果

  1.肠道微生物群在驱动结肠P-gp表达和胃肠稳态功能中的作用。

  用万古霉素治疗的小鼠的结肠组织，而不是用新霉素或甲硝唑治疗的小鼠的结肠组织，显示 P-gp 蛋白表达显着降低(图 1F)。在这些小鼠中，鉴定出5个属与结肠P-gp表达呈正相关，2个属与结肠P-gp表达负相关，表明它们可能影响P-gp蛋白表达(图1G, H，表S1)。在杆菌和梭菌类中发现与 P-gp 表达呈正相关的属(图 1G、H、表 S1)，来自乳酸菌种的培养上清可以在体外诱导P-gp的表达。

  2.肠道菌群诱导P-gp表达。

  首先使用AVNM鸡尾酒清除受体小鼠的微生物群，然后与使用单一抗生素治疗的供体小鼠共住(图2B)。值得注意的是，接受AVNM治疗的小鼠与未接受或接受新霉素治疗的供体共住，肠道P-gp表达恢复，而接受AVNM治疗的小鼠与万古霉素或接受AVNM治疗的供体共住，P-gp表达仍然缺失(图2C)。证实了受体的细菌亚群与供体的细菌亚群的再定植(图2D)，这与万古霉素敏感的细菌群落是诱导体内肠道P-gp表达的必要和充分的假设一致。

  宏基因组分析比较了万古霉素处理和未处理的微生物群，发现Kegg Orthology (KO)组在与结肠P-gp表达高度相关的微生物群中参与了短链脂肪酸和次级胆酸的产生(图3A, B，数据S1)。丁酸盐是肠道中最丰富的短链脂肪酸之一，在癌症研究中已被证明能促进P-gp的表达。并且，生理水平的丁酸盐能在体外诱导 P-gp 表达。相比之下，乙酸和丙酸对P-gp的表达无显著影响(图S3A,B)。此外，丁酸单独在无菌小鼠中足以诱导P-gp表达(图4D)。石胆酸(LCA)，去氧胆酸(DCA)和熊去氧胆酸(UDCA)，在体外诱导P-gp的表达和功能具有相加效应(图4A-C)。用消胆胺隔离胆囊酸治疗小鼠，改变了结肠中二次胆囊酸吸收，特别是UDCA(图S4)，并显著降低了盲肠和结肠中P-gp的表达(图4E, F)，表明需要UDCA才能充分表达P-gp。

  3. 丁酸盐和所有三种的组合时，T84 细胞中 P-gp 表达的诱导显着增强

  相比之下，丁酸与LCA和DCA或单独与UDCA结合不足以观察到这种效果，这表明需要三种胆汁酸(图4A, B)。特别是，观察到的UDCA完全诱导P-gp表达的需求与在体内观察到的胆汁酸隔离的情况类似(图4E, F)。此外， T84 细胞中的 P-gp 功能在与四种代谢物(丁酸盐、LCA、DCA、UDCA)孵育后达到最大，并被 P-gp 选择性抑制剂 PSC833 阻断(图 4C)。值得注意的是，四种代谢物联合诱导的P-gp活性也抑制了强大的趋化剂HXA3驱动的中性粒细胞经上皮细胞迁移(图4G, H)，这一结果与细胞毒性或经上皮细胞抵抗(TER)的改变无关(图S3C, D)。

  4. 这些发现也在一组患有慢性结肠炎症的UC患者的临床样本中得到证实。

  与健康对照组相比，UC患者的P-gp表达显著降低，而且在同一患者的相关区域相对于非相关区域P-gp表达降低(图5B, C)，这与之前的报道一致。除了四名患有严重/泛结肠炎(> 1000 μg/g 钙卫蛋白，表 S2)并推测上皮损伤的患者外，P-gp 表达与绒毛蛋白表达没有显着相关性，再次支持 P-gp 表达的特异性丢失。到目前为止，数据表明P-gp及其eCB底物在UC患者的上皮细胞中减少，表明P-gp阳性调节因子的缺失。最近的一项研究也发现，与UC患者相比，健康对照组中梭菌类(即Lachnospiraceae家族的物种)成员的富集。这些家族成员的功能潜力也与这些研究中确定的小鼠微生物组的功能潜力一致(图 1E、G、H、3，表 S1)。总之，这些数据加强了作者的发现，即微生物源短链脂肪酸和次级胆酸在诱导P-gp表达和功能中发挥了重要作用。

  图解

  图1。结肠P-gp表达需要万古霉素敏感的肠道菌群。(A、D) WT SPF小鼠用AVNM处理10天。结肠组织中P-gp蛋白表达的代表性western blot结果显示，每条线代表每组中一个复制小鼠。N =每组10只;****p < 0.0001，未配对t检验。(B、C) WT SPF小鼠用链霉素(Strep)或头孢哌酮(CFP)治疗7天。(B) P-gp蛋白表达如a所示。代表性的western blot显示，每条线代表每组中一个复制小鼠。N = 6只/组;***p = 0.0003， ****p < 0.0001，单因素方差分析，Dunnett多重比较检验。C显示了抗生素治疗最后一天小鼠粪便中16S DNA相对量的倍差变化。数据来自两个独立实验，每组N = 6 ****p < 0.0001， **p = 0.0028单向方差分析，Dunnett 's多重比较检验，两者的统计检验基于ΔΔCt值。(D)抗生素给药第10天(A, E-H)小鼠粪便中16S DNA相对量与对照相比差异倍数。数据来自两个独立的实验，每组N = 10只小鼠。*p = 0.0178， ****p < 0.0001，单因素方差分析，Dunnett 's多重比较检验，基于ΔΔCt值。(D-H) WT SPF小鼠用万古霉素、新霉素、甲硝唑或AVNM治疗10天。(E)小鼠粪便微生物区系中细菌属的相对丰度。分别给出了两个独立实验的代表性图。N = 5组，每个实验。(F) P-gp蛋白表达如(A, B)。在多个印迹中加入内部控制(“IC”)裂解液进行标准化。具有代表性的western blot显示，每条线代表每组中的一个复制小鼠。N =每组10只;****p < 0.0001, ns p > 0.05，单因素方差分析与Dunnett多重比较检验。A, B, F密度计数据描述了来自两个独立实验的样品。对图1实验测序数据进行Spearman相关检验，G细菌属与结肠p -gp表达呈正相关或负相关，以p < 0.05为显著性。H细菌属的相对丰度与结肠P-gp表达呈正相关。

  图2。革兰氏阳性菌群小鼠定殖足以诱导P-gp表达。(A)WT无菌小鼠用来自WT供体小鼠的盲肠内容物定植。14天后，western blot检测结肠组织中P-gp蛋白的表达。N = 7-10只/组;***p = 0.0005，未配对t检验。(B)W T“供体”小鼠用抗生素治疗7天后的吞噬重建示意图。AVNM处理的WT“受体”小鼠随后与来自其他各组的“供体”小鼠共住7天。(C) P-gp蛋白表达如a所示。代表性的western blot显示，每条线代表每组中一个复制小鼠。内部控制(“IC”)裂解液包含在多个印迹中进行标准化。N =每组6-8只小鼠;****p < 0.0001单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。(A, C)密度计数据描述了来自两个独立实验的样品。(D)，B和C中小鼠粪便微生物群的bry - curtis基于非度量多维标度(NMDS)排序。每个点代表一个代表性实验中的一只小鼠，处理组用颜色表示:Un_R：未治疗受体，Un_D：未治疗供体，V_R：万古霉素受体，V_D：万古霉素供体，N_R：新霉素受体，N_D：新霉素和AVNM供体。

  图3。短链脂肪酸和次级胆汁酸产生菌与结肠P-gp表达呈正相关。(A)一个Volcano图显示了全基因组测序数据中微生物基因(重新分组到KO组)相对丰度与每只小鼠中p -gp表达的rho系数和相应的p值的Spearman相关检验。显著性设置为p < 0.05。标记了与丁酸盐和次级胆汁酸代谢途径有关的KOs。(B)在A中识别的ko与相应的酶委员会(EC)数量、定义和涉及的途径正相关。

  图4。丁酸盐和次级胆汁酸诱导P-gp限制中性粒细胞在上皮细胞上的迁移。(A – C) T84细胞与5 mM丁酸盐、50μM LCA、50μM DCA和/或50μM UDCA共孵育24小时。(A)一个代表性的western blot显示P-gp在裂解物中表达。(B)密度计数据描述了来自至少两个独立实验的样本;*p = 0.0199， ***p = 0.0002， ****p < 0.0001，采用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析。(C) T84细胞按A、B处理，然后测定Rho123保留率。数据反映了Rho123荧光强度的几何平均值逆。数据描述了来自至少两个独立实验的样本;*p < 0.05， ****p < 0.0001，单因素方差分析，各样本与DMSO对照进行Dunnett 's多重比较检验。(D)野生型无菌小鼠灌胃丁酸14 天。western blot检测结肠组织中P-gp蛋白的表达。具有代表性的western blot显示，每条线代表每组中的一个复制小鼠。密度测量数据描述了来自两个独立实验的样品;N = 6-7只/组;***p = 0.0004，未配对t检验。(E、F) WT SPF小鼠饲喂消胆胺(CME) 14天。通过western blot检测P-gp蛋白在结肠组织(E)和盲肠组织(F)中的表达。E, F代表western blot，每条线代表每组中一个复制小鼠。与对照组相比，未加消胆胺组的血药浓度增高。数据描述了来自两个独立实验的样本。每组8只。E *p = 0.0237，未配对t检验。F ***p = 0.0009，未配对t检验。G中性粒细胞迁移实验示意图(BioRender)。将接种于Transwell®平板底部表面的T84细胞与代生物预孵育24小时。将原代中性粒细胞添加到顶部(基底外侧)室，将纯化的hxa3添加到底部(顶端)室，并定量迁移到T84细胞单层的原代中性粒细胞数量。G中的H T84细胞与A-C中的丁酸、LCA、DCA和/或UDCA一起孵育。测定了原发性中性粒细胞穿过细胞单层向顶室hxa3的迁移。所示数据表明单个重复井，并代表至少三个独立的实验;****p < 0.0001, ns p > 0.05，单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。

  图 5. UC人肠内容物不能维持P-gp的表达。(A)人体样本采集图(BioRender)。(B)在人类患者结肠活检中P-gp表达的代表性western blot，显示健康对照组与UC患者，未受精卵组织与受精卵组织，来自相同UC患者的样本用括号表示。(C) B组密度数据，N = 7-9例/组，红色方框表示3例泛结肠炎患者;**p = 0.0012，单因素方差分析，Tukey 's多重比较检验。(D)在人类患者粘膜刷洗中测定棕榈酰乙醇酰胺(PEA)、油酰乙醇酰胺(OEA)和anandamide (AEA) 20:2。N = 4例健康对照组，N = 7-8例uc患者。**p = 0.0013，单因素方差分析，Tukey 's多重比较检验。(E)人患者粪便样本在T84细胞中诱导P-gp的功能性表达。数据归一化为代表性的车辆控制肠道准备液;N = 5-11例/组;*p < 0.05，单因素方差分析与Tukey的多重比较。

  图6。微生物群驱动P-gp表达的工作模型。已经确定了一个包含杆菌和梭菌类的细菌群，足以诱导结肠中P-gp的表达。丁酸盐和这些细菌从膳食基质中产生的次级胆汁酸共同增强了对上皮细胞功能性P-gp表达的诱导，而P-gp能够通过内源性底物(内源性大麻素[2])的外排来阻断中性粒细胞的迁移。观察表明，聚集的细胞内通路放大P-gp的表达;作者认为这些途径包括以下一种或多种:GPCR激活、HDAC抑制、NRF2激活、PXR激活。