高效降解邻苯二甲酸酯的枯草芽孢杆菌：关键酶的降解动力学、代谢途径和催化机制

核心提示：本研究分离自白酒发酵液中的菌株BJQ0005对邻苯二甲酸酯的具有高效的降解率，利用基因组测序和代谢组分析，提出了一种影响邻苯二甲酸酯酶解的机理。

摘要：邻苯二甲酸酯污染环境和食物链的报道屡见不鲜。微生物处理是解决这一问题的绿色有效方法。本研究从白酒发酵液中分离到一株枯草芽孢杆菌BJQ0005，能有效降解邻苯二甲酸酯(PAEs)。邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的半衰期分别为3.93、4.28和25.49小时。基因组测序和代谢中间产物分析了降解邻苯二甲酸酯的整个代谢途径，并表达了来自α/β水解酶家族的18种酶。其中酶GTW28_09400和GTW28_13725能够水解邻苯二甲酸酯的单酯键，而GTW28_17760能够水解邻苯二甲酸酯的双酯键。通过分子对接，提出了影响GTW28_17760邻苯二甲酸单丁的酶促酯键水解的可能机制：第一步水解产生的羧基与催化活性中心的组氨酸相互作用，对酶水解产生负面影响。该研究将促进环境和食品工业中邻苯二甲酸酯的绿色安全处理。

使用全细胞生物催化系统对混合邻苯二甲酸酯进行生物降解

图中显示了该菌株对邻苯二甲酸酯的降解特性：分别选择水稻、小麦和高粱等的常见污染物即邻苯二甲酸酯污染物邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二酸二(2-乙基己基)作为底物来筛选能够降解邻苯二甲酸酯的细菌;图a为当底物的浓度增加到200 mg/L，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二丁酯二异丁酯(DEBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的半衰期分别为4.58、1.72和1.58 h;图b说明当底物达到600 mg/L时，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二丁酯二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的半衰期分别进一步增加到19.5、2.32、2.30和6.96 h;图c为当酶底物浓度为1000 mg/mL时，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的半衰期进一步增加到3.93、4.28和25.5 h;图中可以看出菌株BJQ0005对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二丁酯二异丁酯(DIBP)表现出底物偏好性，在相对较高浓度的邻苯二酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和较低浓度的邻苯二甲酸二乙酯(DEP)下具有较好的降解效率。12 h后，浓度为200 mg/L、600 mg/L和1000 mg/L的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的降解率分别为98.0%、97.0%和84.4%。200 mg/L、600 mg/L和1000 mg/L的邻苯二丁酯二异丁酯(DIBP)在12小时后的降解率约98.9%、96.8%和86.1%，1000 mg/mL的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和1000 mg/mL的邻苯二丁酯二异丁酯(DIBP)在36小时的降解率约为94.4%和94.3%。

基因组序列和注释

图a为菌株BJQ0005全基因组序列信息，该菌株基因组大小为4112497 bp、G+C含量为43.80%;图b表明菌株BJQ0005与枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、耐盐芽孢杆菌(B. halotolerans)、漠海威芽孢杆菌(B. mojavensis)关系密切;图c和d表明根据基因gyrA 和 gyrB进化关系分析，菌株BJQ0005与枯草芽孢杆菌的关系最为密切，因此，被鉴定为枯草芽孢杆菌。

代谢中间产物分析

上图为枯草芽孢杆菌BJQ0005降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)期间代谢中间产物的气相色谱-质谱分析;图a显示通过气相色谱-质谱分析，鉴定1-丁醇为中间体;图b显示为通过气相色谱-质谱分析，鉴定2-乙基己醇为中间体;图c显示了通过气相色谱-质谱分析，鉴定苯甲酸丁酯为中间体;图d说明了通过气相色谱-质谱分析，鉴定了2-乙基己基苯甲酸为中间体;图e为通过气相色谱-质谱分析，鉴定苯甲酸为中间体;其中1-丁醇和2-乙基己醇是通过邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的酯键水解中间产物，苯甲酸丁酯和2-乙基己基苯甲酸可能分别是邻苯二甲酸单丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的脱羧产物，这两种中间体的酯键可以水解生成苯甲酸，邻苯二甲酸也可能通过脱羧反应转化为苯甲酸。

可能的邻苯二甲酸酯降解代谢途径

图a为根据基因组注释信息和目前已知研究，提出了苯甲酸的进一步降解途径;图b为苯甲酸苯环的裂解，进行后续的代谢反应，根据先前的研究，后续代谢反应分为六个阶段，其中，BJQ0005的后续降解途径属于代谢途径V。

邻苯二甲酸酯键水解酶的鉴定

图中显示为过去已经研究了的33种酯键水解酶，它们的基因均被克隆，并构建了表达载体。

图a为通过SDS-PAGE验证酶表达，SDS-PAGE后，表达18个基因;图b和图c显示为GTW28_09400和GTW28_13725实现了邻苯二甲酸酯的单酯键水解，GTW28_17760实现了邻苯二甲酸单丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的双酯键水解。

表中显示了上述用于邻苯二甲酸酯酯键水解的三种酶的基本特征，其中GTW28_09400注释为丝氨酸水解酶，GTW28_13725注释为α/β折叠水解酶，GTW28 _17760注释为对硝基苄基酯酶。

GTW28_17760可能的酯键水解机理

图中显示了GTW28_17760的同源建模以及与邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)和邻苯二酸单异丁酯的分子对接。图a为GTW28_17760的同源模型图，图中显示GTW28_17760的催化活性位点由Ser-189、Glu-310和His-399组成;图b为通过分析蛋白质结构中氨基酸残基的二面角ψ and ϕ来评估模型质量的拉氏图，该酶在完全允许区包含451个氨基酸(92.2%)，在允许区包含24个氨基酸(4.91%)，在不允许区包含14个氨基酸(2.86%)，总长度为489个氨基酸;图c和图d表明，该酶蛋白结构良好，图中显示的模型可用于和邻苯二丁酯二异丁酯(DIBP)对接;图e和图f为GTW28_17760与邻苯二甲酸单异丁酯(MIBP)的分子对接，图中可以看出邻苯二甲酸单异丁酯(MIBP)的羧基通过氢键与酶的His-398相互作用，距离为2.80 Å(绿色箭头)，这影响了His-398在Ser-189上的亲核攻击，最终影响了Ser-189在底物上的亲核攻击，导致催化效率降低，这意味着羧基对酯键的催化作用有很大的影响。

图中显示了GTW28_17760可能的催化机制，图a和b表明，His-399的亲核攻击促进了Ser-189羟基氧原子与底物羧基碳原子的相互作用，形成共价键，导致底物的羧基碳原子和氧原子之间的共价键断裂;图c表明，水分子进入底物结合通道，形成酶-底物四面体跃迁相互作用态;图d表明，底物的羧基碳原子与水分子中的氧原子形成共价键，Ser-189羟基氧原子与底物碳原子之间的共价键被裂解。

图中显示为GTW28_17760分别酶降解邻苯二甲酸单丁酯和苯甲酸丁酯，为了验证羧基对酯键的催化作用有很大的影响，对不含羧基的苯甲酸丁酯作为底物的降解率与邻苯二甲酸单丁酯(MBP)作为底物的降解率进行比较，在相同的反应条件下，GTW28_17760酶水解98.9%±0.20%的苯甲酸丁酯，但仅降解7.69%±4.91%的邻苯二甲酸单丁酯(MBP)。苯甲酸丁酯的降解率约为邻苯二甲酸单丁酯(MBP)的12.9倍，进一步表明底物的羧基抑制了邻苯二甲酸单丁酯(MBP)的酶催化作用。

结论

1、从白酒发酵液中分离出的菌株BJQ0005显示出有效的邻苯二甲酸酯降解。

2、菌株BJQ0005被鉴定为枯草芽孢杆菌，是公认为安全的微生物菌株。

3、测定了BJQ0005的整个代谢途径，以及三种用于酯键水解的酶。

4、提出了双酯键水解酶GTW28_17760的可能催化过程，并确定了邻苯二甲酸单丁酯酯键水解的机理。

参考文献：

Xu, Y., Liu, X., Zhao, J., et al. (2021). An efficient phthalate ester-degrading Bacillus subtilis: Degradation kinetics, metabolic pathway, and catalytic mechanism of the key enzyme. Environmental Pollution, 273. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2021.116461.