核心提示：椰毒假单胞菌酵米面亚种是我国学者于1977年发现的一种高致死性的食源性致病菌。椰毒假单胞菌酵米面亚种中毒的潜伏期一般为30分钟到12小时，少数长达1-2天。

  1.椰毒假单胞菌酵米面亚种是我国学者于1977年发现的一种高致死性的食源性致病菌。椰毒假单胞菌酵米面亚种中毒的潜伏期一般为30分钟到12小时，少数长达1-2天。该菌产生的米酵菌酸是引起严重的中毒和死亡的主要原因，米酵菌酸作用的靶器官是肝、脑、肾等主要实质性脏器。主要表现为上腹不适、恶心、呕吐(重者呈咖啡色样物)、轻微腹泻、头晕、全身无力。重者出现黄疸、肝肿大、皮下出血、呕血、血尿、少尿、意识不清、烦燥不安、惊厥、抽搐、休克等。重症病人多呈肝昏迷， 中枢神经麻痹，并因呼吸衰竭而死亡。一般无发热。目前对米酵菌酸尚无特效解毒药物，一旦中毒，病死率高达40%-100%，只能采取一般的催吐、洗胃、清肠等措施减少毒素的摄入吸收，同时针对患者的症状轻重予以对症治疗，比如保肝、保肾、降低颅内压等，病情及愈后情况与摄入的毒素量有关。救治：洗胃清肠，PE(血浆置换)治疗越早越好(同餐进食未发病按患者治，轻症当重症治，危重重点抢救，减少靶器官损害。)

  2.椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的中毒多发生在夏、秋季节，食品因炎热、潮湿天气，贮存不当而变质。存在于酵米面、粮食加工品(米粉或糯米粉、小米粉、高粱粉)及印尼的椰子粉，变质鲜银耳及其他淀粉类(粉丝、粉条、粉皮、马铃薯粉、凉粉等)发酵产品。北方以酵米面制作的臭碴子、酸汤子、格格豆等为主，南方多以酵米面制作的汤圆和以糯米泡制后做成的吊浆粑、河粉等食品为主)。这些食品的制作具有一个共同的特点，都需要经过长时间发酵或浸泡，一旦被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染，稍不注意，就容易引起中毒。谷物制品(糯玉米、汤圆粉、玉米淀粉、发酵玉米面、凉醋粉等)、薯类制品(山芋淀粉、甘薯淀粉、马铃薯粉条等)。

  3.由于椰毒假单胞酵母菌酵米面亚种不是国际公开发表和承认的细菌分类科学名称，于1999年将其划分为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)的一个病原型，因此2018年9月国家卫生健康委员会发布的《食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验(征求意见稿)》中，将该菌种进行了更名。

  4.唐菖蒲伯克霍尔德菌在自然界广泛分布，在土壤、水体和多种动物等生态位生存，常与真菌和植物共生，种内具有复杂多样性，包含 3 个不同的致病型，分别是唐菖蒲伯克霍尔德菌唐菖蒲致病变种( B .gladiolipvgladioli ，导致树叶等腐烂的病原菌 )、唐 菖 蒲 伯 克 霍 尔 德 菌 洋 葱 致 病 变 种 ( B .gladiolipvalliicola ，导致洋葱腐烂的植物病原菌)、唐菖蒲伯克霍尔德菌蘑菇致病变种( B .gladiolipvagarici cola ，导致蘑菇腐烂的病原菌)。

  5.致病性：

  1) 对人致病：洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)(其中唐菖蒲因产米酵菌酸引起食物中毒)

  2) 对动物致病：鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)

  3) 其他：石竹、皮氏又增加了4个种，植物、荚壳、范氏和越南伯克霍尔德氏菌等，部分细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能。现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域。

  4) 洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)是一种广泛存在于土壤和植物中的非发酵革兰氏阴性细菌。1949年美国的植物病理学家Burkholder首次发现它可以引起洋葱茎腐烂，称为洋葱假单胞菌，1992年Yabuuchi等正式将该菌及其它6个属于rRNA群的假单胞菌归为一个新属，即伯克霍尔德菌属。该属已确认的有25个种

  6.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌：非发酵革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性，卵磷脂酶阳性，36度最适生长，不能氧化分解乳糖、麦芽糖和蔗糖、有动力、产米酵菌酸(BA)和毒黄素(TF)两种毒素。

  7.米酵菌酸(BA)是一种小分子脂肪酸，耐热性极强，即使用100℃的开水煮沸或用高压锅蒸煮也不能破坏其毒性，进食后即可引起中毒，对人体的肝、肾、心、脑等重要器官均能产生严重损害。次氯酸钙、过氧乙酸、日晒、短波紫外线对BA有明显去毒作用。

  8.毒黄素(TF)是一种脂肪酸类小分子物质，呈黄绿色，酸化培养基至PH5.0和增加盐浓度至2%可抑制产毒。

  一、 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检验程序(GB 4789.29-2020)

  二、 前增菌以及选择性分离过程

  前增菌(特殊)：鲜银耳1g+20mL GVC增菌液

  分离：用直径3mm的接种环取增菌液一环，分别划线接种于mPDA平板和PCFA平板，

  36℃±1℃培养24 h～48 h。观察各个平板上生长的菌落。

  GVC增菌液：PD液+葡萄糖龙胆紫氯霉素

  龙胆紫为一种碱性阳离子染料，因其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，影响其代谢而产生抑菌作用。它能抑制革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌。

  mPDA： 改良马铃薯葡萄糖琼脂

  PCFA椰毒假单胞菌酵米面亚种分离琼脂

  mPDA平板：培养24 h后，菌落1 mm～2 mm，紫色，光滑、湿润、边缘整齐;培养48h后，部分菌落中心可有凸起呈草帽状

  PCFA：培养24 h后，菌落0.5 mm～1 mm，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐。

  PCFA：培养24 h后，菌落0.5 mm～1 mm，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐。

  显微形态：PCFA，36℃±1℃培养24h，菌体呈短杆状，单个或成对排列，革兰氏阴性。

  三、 初筛实验

  自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分区划线卵黄琼脂平板，36℃±1℃培养。 挑取培养18～24 h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至48 h±2 h。对于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种PDA平板，36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。

  卵黄琼脂平板(卵磷脂酶试验)：培养24h后，菌落2mm～3mm，表面光滑、湿润，培养48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象。(通常需培养3-4d才看到明显特征)

  PDA平板：36土1℃，24-48h，菌落灰白或乳白色，光滑，边缘整齐，中心有凸起，呈草帽状。

  四、 生化试验

  从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征见下表。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。

  1.葡萄糖代谢类型鉴别试验(氧化-发酵(OF或H L)试验)

  (1) 原理：

  1) 细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型(O)：氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖;

  2) 能进行无氧降解的为发酵型(F)：发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖;

  3) 不分解葡萄糖的细菌为产碱型(A)。

  (2) 试验方法与结果判定：挑取少许纯培养物(不要从选择性平板中挑取)作穿刺接种， 同时接种2管HL培养基，其中一管于接种后滴加溶化的1%的无菌液体石蜡(高度约1cm)以隔绝空气(作为密封管)，另一管不加(作为开放管)。置36℃±1℃培养48h以上。 两管培养基均不产酸(颜色不变)为阴性，产碱型;两管都产酸(变黄)为发酵型;加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

  (3) 应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌(发酵型)与微球菌(氧化型)。 O/F试验用于氧化型与发酵型细菌的鉴别。

  (4) O/F培养基配制注意：①灭菌不用121℃15分钟，以免破坏葡萄糖;②培养基调pH，灭菌后pH6.8为好，若pH过高，产酸量少的细菌不易显出颜色变化;③培养基不应有缓冲作用，以免细菌产酸少而抵消，影响结果;④培养基中葡萄糖与蛋白胨大约为5：1。目的是降低细菌分解蛋白胨形成碱性氨，是分解葡萄糖产酸不能中和。

  五、血清学分型(可选择项)

  1) 菌体抗原的制备：将PDA平板36 ℃士1 ℃培养24 h士2 h的培养物用无菌生理盐水洗下，沸水浴(100℃)2 h，3 000 r/min 10 min离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至5X 108 CFU/mL~1X 109 CFU/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。

  2) 菌体抗原的鉴定：用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用O-Ⅲ、O- Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O- Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一 步鉴定。

  六、毒性试验

  (1) 产毒培养

  将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的菌株接种PDA平板，36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到3mL无菌生理盐水的试管中，配成1麦氏浓度(McFarland，MCF)的菌悬液(约108 cfu/mL)，用无菌吸管吸取0.5 mL，滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌L棒涂布均匀，

  26 ℃±1 ℃培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于100 ℃流动蒸汽灭菌30 min。室温冷却后，置-20 ℃～-30 ℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中(此为毒素粗提液)，4℃避光保存。同时，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150 mm 马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照，按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液(毒力测定实验阳性时，分别取毒素粗提和阴性对照粗提液测定米酵菌酸)，4 ℃避光保存。

  (2) 毒力测定  ATCC 33664 (有毒力  CICC10574无)

  取毒素粗提液或经100 ℃水浴蒸发后的5倍～10倍浓缩液，灌胃 (KM 或ICR，18g～20g)小鼠。3只，每只0.5 mL，观察至7d。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20 min～24 h内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动，继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。

  取阴性对照粗提液或经100 ℃水浴蒸发后的5倍～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只，每只0.5 mL，观察至7d。小鼠应健康存活。

  七、结果报告

  生化试验符合且毒性试验阳性，报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种);生化试验和毒性试验有一项不符合，报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。