空肠弯曲菌感染最常见的症状包括腹泻、腹痛、发烧和呕吐。也能引起自身免疫神经系统紊乱，如格林-巴利综合征(一种使人衰弱、有时致命的瘫痪)也可能发生。

  肉鸡一直是人类弯曲杆菌感染的主要来源，因为这种细菌在肉鸡胃肠道中的定殖水平很高。目前，无论是农场上严格的生物安全措施，还是屠宰场先进的卫生系统，都不足以防止禽肉被空肠弯曲菌污染，这大大增加了经济和公共卫生负担。所有这些因素都表明需要一种灵敏、特异的方法来快速检测食物中的空肠杆菌。

  已经开发了许多方法来鉴定空肠弯曲菌，包括基于培养的试验、最可能数(MPN)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)和实时PCR (rtPCR)。它们有的涉及浓缩、分离和确认而耗时长，有的需要各种繁琐的生化测试来确定目标细菌。

  巢式 PCR(nested PCR)是一种高度敏感和特异性的分子技术，它涉及第一轮PCR产物的第二次扩增。然而，由于额外的一轮PCR，当扩增子从第一反应管转移到第二反应管时，有可能在样品之间交叉污染目标DNA。此外，该方法的过程很复杂，与传统的PCR相比时间增加了一倍。

  单管巢式PCR (Single-tube nested PCR, STN-PCR)是通过设计不同退火温度的内外引物，将两轮PCR分离在一根管中。它大大降低了扩增子交叉污染的风险，提供了与巢式PCR相同或更高的灵敏度水平，并且用更少的时间和试剂。该技术已成功用于检测植物病原体、禽类肉毒中毒和食物中的杏仁过敏原等。

  本研究首次探索了STN-PCR在食品致病菌快速检测中的应用潜力。建立了针对空肠弯曲菌的STN-PCR方法，并对其特异性进行了评价。并与传统PCR法在纯培养物和鸡匀浆中检测空肠弯曲菌的灵敏度进行了比较。采用单管巢式实时PCR (STN-rtPCR)方法对鸡肉糜匀浆中空肠梭菌进行定量检测。将STN-rtPCR与标准培养方法和rtPCR进行比较，比较其对富集的人工污染鸡肉鸡匀浆中低水平空肠弯曲菌的敏感性。

  纯空肠弯曲菌DNA在无DNA水中连续稀释，以4.1×106 ~ 4.1×101 拷贝/μl的空肠梭菌DNA序列稀释倍数为模板，以空肠弯曲菌DNA拷贝数为标准，测定STN- PCR方法的灵敏度，并与常规PCR方法进行比较。传统PCR内引物的检出限为103拷贝数空肠弯曲菌DNA。相比之下，STN-PCR检测灵敏度是传统PCR的100倍。

  图1 传统PCR内引物(上)和STN-PCR(下)空肠梭菌培养DNA的性能1-8：空肠弯曲菌DNA的107、106、105、104、103、102、10、5个拷贝，9：空白对照

  从受污染的匀浆中提取的总DNA用于进一步评价所开发的检测方法的性能。将STN-PCR与传统PCR的灵敏度进行比较。在匀浆中，传统PCR的检出限为3.6×103 CFU/ml，而STN-PCR成功检测空肠弯曲菌的检出限为3.6×101 CFU/ml。STN-PCR检测结果再次表明，该方法对鸡肉匀浆中细菌的检出限比传统PCR法低100倍，显示出其优越的灵敏度。

  图2 常规PCR内引物(上)和STN-PCR(下)从鸡匀浆中提取总DNA实验结果图1-6：在鸡匀浆中3.6×106 CFU/ml至3.6×101 CFU/ml的空肠杆菌，7：未接种的鸡匀浆，8：空白对照(水)

  采用SYBR Green real-time PCR方法对鸡肉糜匀浆中的空肠梭菌进行定量检测。对比STN-rtPCR和常规内引物rtPCR的扩增效率，构建两种方法的标准曲线。所有未接种的对照样品和水对照检测均为阴性。

  图3 (A)常规rtPCR扩增生成的标准曲线;(B)STN-rtPCR扩增生成的标准曲线

  样品中背景菌群浓度为2 ~ 4 lg CFU/ml。常规rtPCR的检出限为3.6×103 CFU/ml, Ct值为28.10±0.74。STN-rtPCR的检出限为3.6×101 CFU/ml, Ct值为25.08±0.10，灵敏度明显高于常规rtPCR。常规rtPCR检测效率为100%，STN-rtPCR检测效率为96.33%。

  本研究成功建立了一种基于hipO基因的新型STN-PCR方法，可快速、灵敏地检测空肠弯曲杆菌。据作者所知，目前的研究是第一份证明STN-PCR在食品病原体检测中的潜力的报告。

  该方法的检出限为10个空肠弯曲菌DNA拷贝，比含内引物的常规PCR方法低100倍。此外，采用SYBR Green的STN-rtPCR检测成功地检测到未富集的人工污染的鸡肉匀浆中低至3.6×101 CFU/ml的空肠梭菌。富集24 h后，用STN-rtPCR检测初始接种量为0.1 CFU/g空肠杆菌的鸡匀浆。

  实验结果表明，STN-rtPCR方法是一种准确检测和定量鸡肉糜中空肠梭菌的有效方法。该方法显著减少了与巢式PCR相关的靶DNA交叉污染，检出限极低，优于传统PCR方法。此外，该检测方法克服了基于培养的方法的非特异性问题，并允许在相当短的时间内识别鸡中的目标食源性病原体。

  参考文献：Wu B, Hu JS, Li Y. Development of an ultra-sensitive single-tube nested PCR assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in ground chicken. Food Microbiol. 2022 Sep;106:104052.