核心提示：酒精性肝炎是由于长期大量饮酒而导致的肝脏疾病，酒精引起的肝脏类疾病能够随着粪便菌群移植而转移，提示肠道微生物在酒精引起的小鼠肝脏类疾病中扮演着重要的作用，但其具体机制仍未得到阐明。
导读
酒精性肝炎是由于长期大量饮酒而导致的肝脏疾病，据统计，酒精性肝炎的患者在患病前6个月的死亡率高达20%~40%，严重的酒精性肝炎病人甚至在确诊后的90天内死亡。目前使用较多的糖皮质激素类药物仅能起到部分缓解作用，在疾病早期进行的肝脏移植被认为是治愈该疾病的唯一办法。然而，仅有少数患者能够进行肝移植手术。酒精引起的肝脏类疾病能够随着粪便菌群移植而转移，提示肠道微生物在酒精引起的小鼠肝脏类疾病中扮演着重要的作用，但其具体机制仍未得到阐明。
作者在此鉴定出了由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)所分泌的外毒素溶细胞素(cytolysin)是导致酒精性肝病的罪魁祸首。与正常人群相比，长期大量饮酒的人群肠道中粪肠球菌丰度急剧增加。利用人源化肠道菌群小鼠，作者发现靶向粪肠球菌的噬菌体疗法能够有效杀灭分泌cytolysin的粪肠球菌并缓解肝脏损伤。该研究有望推向临床，通过定向杀灭致病细菌的方式精准编辑肠道菌群，用于治疗酒精性肝炎。
原名：Bacteriophage targeting of gut bacterium attenuates alcoholic liver disease
译名：以肠道细菌为靶标的噬菌体可以减轻酒精性肝炎
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.11
第一作者：段屹
作者单位：美国加州大学圣地亚哥分校
实验设计
① 作者首先利用16s rDNA测序寻找慢性酒精摄取人群、酒精性肝炎患者以及正常人群肠道中细菌组成的差异，寻找到了显著差异菌群Enterococcus spp.。
② 随后使用qPCR检测粪便样本中Cytolysin-positive和Cytolysin-negative的粪肠球菌的比例，并利用生存曲线将其与患者生存率关联。
③ 接着使用酒精诱发肝炎小鼠模型，同时灌胃给予cytolytic E. faecalis和non-cytolytic E. faecalis，观察小鼠肝脏损伤情况。采用人源化肠道菌群小鼠模型评价酒精性肝炎患者肠道菌群对于酒精引起肝脏损伤的易感性，并且体外使用原代肝细胞给予Cytolysin，直接观察其对细胞的杀伤作用。
④ 基于上述研究结果，作者又采用靶向Cytolysin-positive粪肠球菌的噬菌体，观察其对于酒精性肝炎的缓解作用。
结果
1、溶细胞素与酒精性肝炎高死亡率密切相关
首先我们采用16srRNA测序的方式检测正常人群、滥用酒精人群以及酒精性肝炎人群肠道细菌的组成丰度。PCoA分析发现后两者人群的肠道菌群组成与正常人群存在差异(图1A)。其中，最重大的差别来自于Enterococcusspp.丰度的急剧升高。我们发现在酒精性肝炎患者中，约有5.59%的肠道菌群是Enterococcusspp.，而在正常人群这一数值仅仅为0.023%(图1B)。采用qPCR方式对粪便中E.faecalis进行定量也得到了了类似的结果(图1C)。先前的报导表明，E.faecalis的定植会引起小鼠肝脏脂肪变性，同时加剧酒精诱发的肝脏损伤，但其具体机制尚不明确。我们发现溶细胞素(Cytolysin)是一种由E.faecalis分泌的细菌外毒素，可分为CylLL和CylLS两种。溶细胞素能够溶解细胞，破坏细胞膜并导致细胞死亡。30%酒精性肝炎患者样本中存在cytolysin-positive E.faecalis，正常人完全不存在，并且酒精滥用人群也仅有1人检测出含有cytolysin-positive E.faecalis(图1D)。令人惊讶的是，89%含有cytolysin-positive E.faecalis的患者在180天内死亡，而cytolysin-negative的患者几乎不出现死亡(死亡率仅~3.8%)(图1E)。为了研究不同病人肠道内E.faecalis的进化演变规律，我们从24个患者样本中分离共得到93种E.faecalis，利用进化树分析我们发现cytolysin-positive E.faecalis的基因多样性，表明了编码cytolysin的基因存在于可移动基因元件中(图1F)。
图1粪肠球菌产生的溶细胞素与酒精性肝炎患者密切相关。Control：健康人群；AUD：滥用酒精人群；Alcoholichepatitis：酒精性肝炎人群。(A)PCoA分析显示各组人群肠道细菌组成的差异(β多样性分析)；(B)细菌丰度堆积图；(C)不同人群粪便样本中cytolysin-positive/negative的E.faecalis占比；(D)含溶细胞素与不含溶细胞素酒精性肝炎患者的生存曲线分析；(E)24位患者中分离得到共93种E.faecalis的SNP进化树分析。
2、溶细胞素加剧酒精引起的肝脏损伤
为了研究溶细胞素对于肝脏的损伤作用，我们将能够分泌cytolysin的E. faecalis strain (FA2-2(pAM714))和不能分泌cytolysin的E. faecalis strain(FA2-2(pAM771))定植于小鼠，随后使用酒精诱导小鼠酒精性肝炎模型。我们发现给予cytolytic E.faecalis其肝脏损伤更为严重，表现为血清ALT水平升高以及肝脏脂肪细胞变性增多(图2A-C)。相关炎性因子的mRNA水平也明显升高，包括Il1b，Cxcl1和Cxcl2(图2D-F)。而给予无cytolysin的E. faecalis小鼠则无上述现象，说明cytolysin对于肝脏的重要损伤作用。同时，我们发现肝脏中能够检测到E. faecalis(图2G)，说明酒精破坏肠道屏障对于细菌肝脏的移位有着重要作用。
图2 cytolysin-positive E.faecalis定植加剧酒精引起的肝脏损伤。黑色：control组；棕色：分泌cytolysin的E. faecalis组；蓝色：不分泌cytolysin的E. faecalis组。(A)血清ALT水平；(B)肝脏甘油三酯水平；(C)肝脏切片油红O染色；(D-F)肝脏组织Il1b，Cxcl1和Cxcl2的mRNA表达水平；(G)肝脏组织中培养得到E. faecalis的CFU值。
随后我们分别将cytolysin-positive和cytolysin-negative的酒精性肝炎患者菌群定植于无菌小鼠中，构成人源化肠道菌群小鼠模型。同样地，我们发现cytolysin-positive患者的肠道菌群能够引起更为严重的肝脏损伤(图3A)、脂肪变性(图3B-C)、炎症水平(图3D-E)以及肝脏纤维化程度(图3F)。肝脏组织内的CylLs基因水平也显著升高(图3G)，且这些现象与酒精的摄入与否无关。CylLL和CylLS能够对体外原代肝细胞有着直接的杀伤作用，表明两种cytolysin都会引起肝脏细胞的死亡(图3H)。
图3 Cytolysin-positve患者肠道菌群引起酒精性肝损伤的加剧。红色：小鼠移植cytolysin-positive No.1患者的肠道菌群;黄棕色：小鼠移植cytolysin-positive No.2患者的肠道菌群;绿色：小鼠移植cytolysin-negative No.1患者的肠道菌群;蓝色：小鼠移植cytolysin-negative No.2患者的肠道菌群。(A)血清ALT水平;(B)肝脏甘油三酯水平;(C)肝脏组织切片HE染色结果图;(D-E)肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平;(F)肝脏组织Col1a1的mRNA表达水平;(G)肝脏cylLs基因的表达情况;(H)原代肝细胞体外给予不同浓度CylLS以及CylLL对于细胞的杀伤作用(检测上清LDH的释放)。
3、靶向cytolytic E. faecalis的噬菌体有望治疗酒精性肝炎
紧接着，我们希望通过噬菌体疗法，进一步说明溶细胞素对于酒精性肝炎的重要作用。噬菌体在肠道中广泛存在，粪肠球菌的噬菌体能够精准分离得到，因而我们可以利用噬菌体来靶向调控肠道菌群。从Atp4aSl/Sl小鼠肠道中分离得到的E. faecalis同样能够分泌cytolysin，我们利用该细菌来验证从污水中分离得到的4种噬菌体的特异性，结果表明这几种噬菌体都能够裂解E. faecalis。因此我们给予Atp4aSl/Sl小鼠酒精并灌胃给予噬菌体混合物，同时使用不靶向肠道内任何细菌的噬菌体作为对照。我们发现靶向cytolytic E.faecalis的噬菌体给予后，小鼠的肝脏损伤(图4A)、脂肪变性(图4B-C)、炎症水平(图4D-F)得以显著降低。肝脏内cytolysin的水平也得到了降低(图4G)，同时肠道中粪肠球菌的数量也明显下降(图4H)。而噬菌体的介入并不影响肠道菌群的组成以及肠道对于酒精的摄取能力(图4I-K)。
图4噬菌体减轻酒精诱导Atp4aSl/Sl小鼠的肝脏损伤。(A)血清ALT水平；(B)肝脏甘油三酯水平；(C)肝脏组织切片油红O染色结果图；(D-F)肝脏组织Il1b，Cxcl1，Cxcl2的mRNA表达水平；(G)肝脏cylLs基因的表达情况；(H)粪便中粪肠球菌的数量；(I)血清乙醇含量；(J-K)在给予/不给与酒精情况下使用噬菌体对肠道菌群的影响(PCA主坐标分析)。
最后我们希望利用靶向cytolytic E. faecalis的噬菌体从而治疗酒精性肝炎。我们从污水中分离得到多种对于酒精性肝炎患者肠道内cytolytic E.faecalis有着明显降解作用的噬菌体，发现这些噬菌体属于长尾噬菌体或肌尾噬菌体(图A)。定殖了酒精性肝炎患者肠道菌群的无菌小鼠给予对应的噬菌体后，能够明显抑制酒精引起的肝脏损伤，包括ALT、甘油三酯以及脂肪变性水平降低(图5B-D)，炎性因子(图5E-F)以及肝脏纤维化水平降低(图5G)。肠道内粪肠球菌的数量明显下降(图5H)，并且噬菌体的引入也不影响肠道菌群的组成以及肠道对于酒精的摄取能力(图5I-K)。
图5噬菌体减轻酒精诱导人源化肠道菌群小鼠的肝脏损伤。(A)电镜观察得到的噬菌体结构，Ef5.1、Ef5.2、Ef5.3、Ef5.4以及Ef2.2属于长尾噬菌体，Ef2.1以及Ef2.3属于肌尾噬菌体;(B)血清ALT水平;(C)肝脏甘油三酯水平;(D)肝脏组织切片HE染色结果图;(E-F)肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平;(G)肝脏Col1a1基因的表达情况;(H)粪便中粪肠球菌的数量;(I)血清乙醇含量;(J-K)在给予/不给与酒精情况下使用噬菌体对肠道菌群的影响(PCA主坐标分析)。
为了证明噬菌体发挥的治疗作用是由于其对于cytolysin-positive的E. faecalis杀灭作用，而不是作用于cytolysin-negative的E. faecalis，我们又将cytolysin-negative酒精性患者的肠道菌群定植于无菌小鼠中，同样从污水中分离得到靶向non-cytolytic E.faecalis的噬菌体，发现这些噬菌体并不会缓解酒精性肝炎的疾病状态，尽管肠道内的粪肠球菌数量明显下降，表明cytolysin-positive的粪肠球菌是治疗酒精性肝炎的重要靶点。
图6靶向non-cytolyticE.faecalis不能缓解酒精性肝炎。(A)电镜观察得到的噬菌体结构，Ef6.2、Ef6.3、Ef7.2、Ef7.3以及Ef7.4属于短尾噬菌体，Ef6.1、Ef6.4以及Ef7.1属于长尾噬菌体;(B)血清ALT水平;(C)肝脏甘油三酯水平;(D)肝脏组织切片HE染色结果图;(E-F)肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平;(G)肝脏Col1a1基因的表达情况;(H)粪便中粪肠球菌的数量。
讨论
噬菌体疗法主要用于治疗肠道、泌尿系统等部位的细菌感染，这些研究表明了利用噬菌体疗法治疗细菌感染并不会如抗生素疗法一般引起肠道菌群的改变。
① 我们首先确证了能够分泌溶细胞素的粪肠球菌与酒精性肝炎患者的死亡率密切相关，并且其能够加剧酒精引发的小鼠肝脏损伤。
② 随后我们确证了溶细胞素是粪肠球菌引发肝脏损伤加剧的主要原因，并且溶细胞素能够直接导致肝细胞的死亡。
③ 接着我们使用噬菌体疗法，进一步确证了cytolytic E.faecalis是酒精引发肝脏损伤的原因，并发现靶向cytolysin-positive的粪肠球菌能够明显缓解肝脏损伤。
消除患者肠道中的粪肠球菌也许能够成为比现有治疗策略更加优秀的疗法，同时在环境中也能够轻松获取到靶向粪肠球菌的噬菌体。本文中我们利用噬菌体治疗了非感染性疾病，同时cytolysin也可以被认为是重度酒精性肝炎的biomarker。
