核心提示：经验性广谱抗生素治疗尿路感染（Urinary tract infections, UTIs）刺激了细菌耐药性的发展。临床上迫切需要一种快速诊断工具，既能实现病原鉴定（ID），又能给出抗生素敏感性测试（Antibiotic Susceptibility Testing, AST）结果。在这项研究中，利用分子杂交技术在液滴中进行单细胞水平的细菌16S rRNA的检测，使得在30 min内即可实现尿液样本中病原鉴定和AST分析。
摘要
经验性广谱抗生素治疗UTI刺激了细菌耐药性的发展。临床上迫切需要一种快速诊断工具，无需繁琐样本处理过程即可实现病原鉴定(ID)，并给出病原药敏测试结果。为此，研究基于液滴微流控开发了一个能够在30min内实现尿液样本中病原鉴定和AST分析的平台。该平台通过将荧光杂交探针与单个细菌的16S rRNA包裹在皮升体积的液滴中，在经历16 min的分子杂交过程后即可完成UTI致病菌鉴定。另外，液滴中单个细菌的16S rRNA检测方案将细菌培养/抗生素暴露时间缩短至10 min，成为新的快速AST方案。研究开发了一个全集成的微流控芯片，能够从尿液样本给出七种可能诊断结果，包括革兰氏阴性菌存在/不存在，鉴定大肠杆菌、肠杆菌目或其他生物体(ID)，以及评估细菌对环丙沙星的敏感性。研究利用50例尿液样本评估方法的临床应用价值，结果显示该方法仅需临床标准方法的小部分时间，即可完成病原鉴定并给出可靠的AST结果(曲线下面积，AUC > 0.95)。
实验操作流程及检测原理
研究发展了一个DropDx全集成平台，以实现“样本进-结果出”的UTI诊断。DropDx由以下几个单元构成：流聚焦液滴生成模块，用于液滴孵育的特氟龙管，37 ℃，95 ℃，60 ℃ Peltier加热单元，10 μm检测通道及其与之对齐的双色激光诱导荧光检测器(LIF)(图A和B)。
实验时，将细菌、荧光杂交探针(靶向待检细菌的16S rRNA)和抗生素(或者不加)封装入pL液滴中。在经历10 min的抗生素暴露/细菌培养后(37 ℃)，热裂解细菌释放出16S rRNA(95 ℃)，荧光探针高特异地与之杂交配对(60 ℃，16 min)，利用LIF检测液滴荧光信号。研究通过对杂交探针标记不同颜色的荧光基团，实现多种病原鉴定。研究通过在单细胞水平上检测病原16S rRNA，比较液滴的荧光强度即可完成AST分析。这是由于液滴的荧光强度与其中含有的16S rRNA数量呈正相关关系。如果液滴是空液滴/不含靶标细菌，液滴没有荧光或者荧光较弱。如果液滴中含有靶标细菌，没有用抗生素处理，则其16S rRNA数量会增加，LIF会收集到很强的荧光信号。此种情况下的16S rRNA数量高于加药处理细菌后表现为敏感的检测组，等同于加药处理细菌后表现为耐药的检测组，因而荧光强度也会有所差异，可用于判断细菌敏感/耐药性(图C)。
主要结果
1. 杂交探针特异性
研究设计了大肠杆菌(E. coli, EC)、奇异变形杆菌(P.mirabilis, PM)、包括EC，PM，克雷伯氏菌(Klebsiella, KP)、柠檬酸杆菌和沙雷氏菌的肠杆菌目(Enterobacterales, EB)的探针和一个靶向所有细菌的16S rRNA的通用探针(universal, UNI)，并验证了EC、PM、EB探针的高特异性和UNI探针的通用性(图A)。研究也利用EC探针和EC标准菌株验证了细菌裂解温度和核酸杂交温度对信噪比的影响，结果显示在不同的温度条件下信噪比无明显变化(图B)。另外，文章探讨了在20 μL反应体系基于荧光强度区别敏感/耐药菌的可行性，但是所需孵育时间长达90 min(图C)。
2. 尿液模拟样本验证液滴中单细胞16S rRNA检测方案可行性
研究发展了一个梯度过滤装置(35-2.5 μm)去过滤尿液样本中的杂质，并在样本输入DropDx前利用MH培养基对尿液进行4倍稀释，处理后的样本能够稳定的形成4±1 pL单分散液滴(图A)。研究向空白尿液样本中加/不加EC(107 CFU/mL)验证了DropDx能够实现单细胞16S rRNA的检测：不含EC的液滴荧光强度较低(阴性)，含有大肠杆菌的液滴荧光强度较高(阳性)。由于某些杂质未被过滤掉，仍存在假阳性液滴(0.0079%)。加入EC的模拟尿液样本的EC检测值为1.67×107CFU/ml，与理论值基本一致(图B)。随后，研究利用模拟尿液样本验证了方案检测可行性，结果显示细菌检测值与理论值呈现较好的线性相关性(R2=0.992)(图C)。另外，研究对液滴体积进行优化以尽量缩短诊断分析时间，明确当液滴体积为4 pL时的核酸杂交时间可以缩短为15 min，且能观察到空液滴以获得后续的阳性液滴占比(图D)。
3. 基于液滴的单细胞定量检测16S rRNA的AST方案可行性
研究基于DropDx平台利用EC和EC探针验证了液滴中的细菌培养/抗生素暴露处理后液滴内的16S rRNA数量存在差异，表现在荧光强度差异上。另外，经历30 min抗生素暴露的实验组的阳性液滴数目减少，验证了细菌生长受到了抑制(图A)。研究也优化了液滴中能够实现敏感/耐药菌良好区分的抗生素暴露时间(图B和C)。
4. DropDx的临床应用价值评估
研究通过2个DropDx平行单元进行50例非复杂性尿路感染样本的病原鉴定和环丙沙星药敏分析(图A)。这样的设计，可以实现在30 min内得到7种UTI诊断结果(图B)：EC感染(敏感)，EC感染(耐药)，非EC的EB感染(敏感)，非EC的EB感染(耐药)，其它致病菌(敏感)，其它致病菌(耐药)。对于这50例临床样本，分为2组平行实验，一组按照临床相关流程(细菌分离培养→质谱鉴定病原ID→BD Phoenix完成AST分析，48小时)，一组利用DropDx(2个平行单元)进行检测。结果显示，DropDx的检测结果与临床诊断结果基本一致(图C)。首先，DropDx可以辨别是否是革兰氏阴性菌感染(p=0.01)，有一株假阴性可能是因为细菌浓度太低或者尿液杂质引起过高的背景荧光。其次，DropDx可以从判定为革兰氏阴性菌感染的样本中判定出EC感染(p=0.001)。再者，检测出EB感染(p=0.02)。且在病原ID鉴定过程中，具有较高的AUC曲线下面积(图D)。
结论
研究发展了一个全集成DropDX平台，是首个将液滴微流控用于单细胞细菌16S rRNA检测的UTI诊断平台，能够在30 min内实现尿液样本中病原鉴定和AST。该研究具有两个创新点：首先，研究将细菌16S rRNA作为分子标记物用于表型-分子型AST，热裂解细菌后即可完成病原鉴定和AST，简化了样本处理。其次，单细菌细胞16S rRNA封装入一个pL液滴，利用形成的液滴完成细菌16S rRNA的高通量检测，大大缩短了病原鉴定和AST分析时间，为表型-分子型AST开辟了一个新思路。
