核心提示：类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性和炎症性疾病，有研究表明RA受口腔和肠道细菌的影响。然而，人们对口腔或肠道病毒组与RA之间的关系知之甚少。文章认为，RA不仅与细菌丰度相关，与作为微生物组重要组成部分的病毒应该也有一定相关性。
类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性和炎症性疾病，有研究表明RA受口腔和肠道细菌的影响。然而，人们对口腔或肠道病毒组与RA之间的关系知之甚少。文章认为，RA不仅与细菌丰度相关，与作为微生物组重要组成部分的病毒应该也有一定相关性。因此，文章使用宏病毒组分析方法，分析治疗与非治疗的RA患者口腔和肠道群落中的病毒种群分布情况，构建了病毒-细菌相互作用网络，并与RA相关指标进行相关性分析。
基本概述
文章分析了来自497个牙菌斑、唾液和粪便样本的总共2.72 Tbp的高质量非人类宏基因组数据。宏基因组组装共产生2,664,228个重叠群(长度>=5,000bp)，其中6.1%(n = 161,828)被认为是高度可信的病毒片段。去除冗余病毒重叠群后，分别从牙菌斑、唾液和肠道宏基因组中识别出总共19,483、28,123和30,805个病毒操作分类单元(vOTU)。
基于通过CheckV的评估，15.5%的vOTU是高质量或中等质量的病毒基因组，其余的vOTU通常是低质量的病毒片段或未确定的序列(图 S2)。总共有55.1%的vOTU可以被分类到已知的科中。然而，只有6%的vOTU与RefSeq数据库中可用的测序病毒显示出95%的核苷酸相似性，突显了口腔和肠道病毒数据集是相当新颖的。
口腔和肠道病毒组的分布情况
文章发现，牙菌斑和唾液宏基因组之间共享的vOTU比例显著较高(牙菌斑中的93.6%和唾液中的94.6%)，并且它们与肠道病毒组共享的vOTU数量相对较少(牙菌斑中的85.2%和唾液中的84.9%)(图 1A)。在口腔样本中也检测到了总共77.9%的肠道病毒组的vOTU，其余22.1%的vOTU是肠道特异性的。
关注来自三个采样区的病毒多样性，文章发现，与牙菌斑(6.3%)相比，粪便样本在宏基因组中的病毒序列比例(平均为14.0%)显著较高。和唾液(9.5%)样本(图 1B，左)。然而，唾液样本比牙菌斑和粪便样本具有更高的样本内多样性(由香农指数估计)和丰富度(由观察到的 vOTU 数量估计)，而这些参数在粪便样本中最低(图 1B)。
基于vOTU组成的主成分分析(PCA)揭示了3个采样区之间的明显分离(图 1C)。一致地，布雷-柯蒂斯距离表明，肠道病毒组远离牙菌斑和唾液病毒组(图 1D)。在科级别，所有三个采样区基本都为五个科的病毒(忽略科级未分类的 vOTU)：Siphoviridae、Myoviridae、Herelleviridae、Autographiviridae和Phycodnaviridae(图 1E)。与牙菌斑和唾液样本相比，肠道病毒组的Siphoviridae比例较低，而其他4个科的比例较高。
图 1 口腔和肠道病毒组概述
未经治疗和治疗的RA患者的口腔和肠道病毒组受到干扰
对于牙菌斑病毒组，未治疗和治疗的RA患者的香农指数显著低于健康对照组(图 2A)。未经治疗的患者的病毒丰度接近健康对照组，而接受治疗的患者的病毒丰度显著低于其他受试者(图 2B)。基于距离的冗余分析(dbRDA)和环境分析显示存在明显的偏差(R2 = 29.2%;P = 0.001)(图 2C)。679个高丰度vOTU中的14个相对丰度差异显著。这些vOTU包括一种乳球菌噬菌体(vOTU70)，治疗组的牙菌斑病毒组富含该噬菌体(图 S4A);作者认为这种现象可能与一些RA患者使用乳制品有关。
对于唾液病毒组，三个分组的香农指数相等，而接受治疗的患者的病毒丰富度显著低于未治疗的患者和健康对照组(图 2E、F)。dbRDA和环境分析显示三个分组之间存在明显的偏差(R2 = 30.8%;P = 0.001)(图 2G)。633个高丰度vOTU中共有463个在相对丰度存在显著差异。与牙菌斑病毒组不同，乳球菌噬菌体vOTU70在健康受试者和接受治疗的RA患者的口腔病毒组中均富集(图 S4B)。在科水平上，其中占优势的病毒科Autographiviridae在未经治疗的患者中显著富集。
对于肠道病毒组，香农指数和病毒丰富度值在三个分组中相似(图 2I、J)。dbRDA和环境分析揭示了明显偏差(R2= 14.2%;P = 0.001)(图 2K)，但与牙菌斑和唾液病毒组相比，RA的影响对肠道病毒组相对较小。975个高丰度vOTU中的73个在相对丰度存在显著差异。此外，只有藻类病毒科的丰度在三个分组之间存在差异(图 2L)，并且在接受治疗的 RA 患者的肠道病毒组中显著降低。
总而言之，文章中的研究结果表明病毒多样性、vOTU数量和科组成在未经治疗和治疗RA患者的口腔病毒组中存在显著改变，而这些改变在RA患者的肠道病毒组中发生率相对较低。
图 2 RA 患者口腔和肠道病毒组的群落变异
在接受治疗的RA患者中，病毒和细菌的相互作用被破坏
基于独特进化枝的读取映射，通过总计225个高丰度物种(所有样品中的丰度为 0.05%)对所有样品的细菌微生物组进行量化：35 种、59 种和 6 种在三个采样区中具有不同的相对丰度。
着眼于病毒多样性，文章发现香农指数在所有三个生态系统和所有群组中的病毒组和细菌组之间存在很强的相关性(图 3A)，表明病毒和细菌之间存在广泛的联系。为了研究这种相互作用，作者在75个高丰度vOTU和225个细菌物种之间建立了共丰度网络(图 3B)。在牙菌斑组中，未经治疗的RA患者的病毒-细菌关联最高，其次是健康对照组，RA患者最低(图 3B)。此外，健康对照组和未治疗的RA患者之间的相关性比治疗的RA患者更密切。肠道病毒组也观察到类似的结果(图3D)。在唾液中，病毒-细菌关联最常出现在健康对照组中，而接受治疗的RA患者显著减少(图 3C)。
总体而言，这些发现表明，在接受治疗的RA患者中，病毒-细菌相互作用网络被破坏。
图 3 细菌组和病毒组之间的相关性
口腔病毒和细菌经常与RA相关的临床指标相关联
根据上述分析的结果，三个分组(未治疗和治疗的RA患者和健康对照)的显著分离说明治疗显著影响了vOTU物种水平的口腔和肠道病毒组和细菌组，并且这种影响在唾液病毒组和细菌组中最高，但在肠道病毒组和细菌组中最低(图4A)。在宿主人口统计学变量中，年龄和性别对牙菌斑病毒组和细菌组有相当大的影响，但与肠道病毒组无关，而BMI和体重与肠道病毒组和细菌组显著相关(图 S6A)。在临床参数中，文章发现几个RA相关指标与口腔病毒组显著相关。例如，C响应蛋白(CRP)、一般健康(GH)和RA持续时间与牙菌斑病毒组相关，而临床疾病活动指数(CDAI)、疾病活动评分28(DAS28)、疾病活动和GH与口腔病毒组相关(图 4B)。在这些药物中，甲氨蝶呤(MTX)指数与物种水平的肠道细菌组和家族水平的牙菌斑细菌组显著相关，但与口腔和肠道病毒组无关(图S6C)。此外，口腔病毒组与其他几个临床指标相关，例如牙菌斑病毒组与血红蛋白(HGB)相关，唾液病毒组与血小板(PLT)和白细胞(WBC)计数相关。
文章生成了一个包含6种RA相关临床指标和微生物(包括所有样本中平均相对丰度为0.05%的病毒和细菌)的大型相关网络(图 4C)。所有指标都与牙菌斑和唾液中的多种细菌和病毒相关，但只涉及相对少量的肠道微生物。几种牙菌斑微生物，包括 Actinomyces massiliensis、Treponema socranskii、Eubacterium brachy和Lactococcus phage vOTU70，以及几种唾液微生物，包括 Lactococcus lactis、Bacteroides vulgatus、Escherichia coli和Lactococcus phage vOTU70，是该网络中的关键类群，主要与CDAI、GH、CRP、DAS28和疾病活动有关。
总之，这些发现揭示了口腔病毒、细菌和RA相关临床指标之间的广泛联系。
图 4 病毒组、细菌微生物组和临床指标之间的相关性。边权重表示相关性的强度。节点大小(对于微生物)表示不同栖息地中类群的相对丰度。
通过使用病毒和细菌群落预测RA状态
最后，文章使用随机森林模型根据细菌组和病毒组将个体分为三种状态。每个模型都具有高度丰富的细菌种类和vOTU(0.05%相对丰度和显著差异)。通过留一法交叉验证方法评估每个模型的性能。对于牙菌斑，细菌组的曲线下面积(AUC)分别为80.54%、84.57%和77.46%，用于区分未治疗患者与对照组、治疗患者与对照组以及未治疗患者与治疗患者(图 5A)。对于牙菌斑病毒组，未治疗患者和对照组之间的区分水平(AUC = 71.15%)远低于未治疗和治疗患者之间的区分水平(AUC = 94.3%)(图 5B)。
将细菌组和病毒组相结合，分别获得了81.57%、89.4%和94.93%的AUC，用于区分未治疗的患者与对照、治疗的患者与对照以及未治疗的患者与治疗的患者(图 5C)。对于唾液细菌组和病毒组，AUC几乎与牙菌斑的AUC相当，区分未治疗患者与对照的能力更高，区分治疗患者与对照的能力较低(图 5D-F)。相反，对于肠道细菌组和病毒组，AUC显著低于牙菌斑和唾液的AUC(图 5G-I)。
这些结果表明，与粪便中的微生物相比，牙菌斑和唾液中的微生物对RA状态具有更高的预测能力。
图 5 来自健康对照和未治疗和治疗的RA患者的样品分类
参考文献：
[1] Guo R , Li S , Zhang Y , et al. Dysbiotic oral and gut viromes in untreated and treated rheumatoid arthritis patients. Cold Spring Harbor Laboratory, 2021.
DOI：10.1128/spectrum.00348-22
