怎么给致病菌“做核酸”？致病菌的核酸检测有哪些方面

  致病菌的核酸检测涉及到核酸提取，核酸扩增，核酸扩增系统的形成，信号读取多个方面。在核酸提取过程中，磁性微球由于其好的吸附能力和简单的操作方式在捕获DNA的过程中具有很强的发展潜力。核酸扩增的具体方法中主要分为非等温核酸扩增和等温核酸扩增，主要代表有PCR、LAMP、RPA，其中RPA目前使用广泛发展迅速。核酸扩增系统主要有基于液滴形成的扩增体系和基于微室形成的扩增体系。在信号读取这一方面，包括机器学习和图像处理技术在内的数据分析方法的发展是一门新的研究方向。

  核酸提取是整个分子检测的第一步，核酸提取的结果直接影响后续试验过程。如果能将核酸提取过程放置在芯片当中，能够有效缩短检测时间，提高检测自动化程度，减少气溶胶污染。可以选择在芯片中设有专用裂解室，并添加磁性微球吸附核酸，随后使微球分布到微室中进行核酸扩增和信号读取，但是由于磁性微球具有强的背景荧光，所以需要消除干扰，避免影响信号读出。

  核酸扩增中PCR仍是应用最成熟最广泛的技术，虽然对温度要求高，但是也因此能够消除非特异性扩增，减少假阳性风险。但是由于温度的要求，限制其在核酸检测中的发展。因此相对应的改进的核酸扩增办法有恒温核酸扩增，目前最常用的核酸扩增方法是LAMP，与PCR相比，LAMP不易受到抑制剂影响，可以充分利用未加工过的核酸，有多种信号输出方式，但是容易产生假阳性结果，而且引物数量多，筛选繁琐。RPA的扩增过程在常温下即可进行，而且是通过加入化学引发剂来开始反应，因此对温度控制要求较低，并且引物设计简单。但由于不依赖于温度开始反应，容易引起非特异性扩增，增加假阳性的概率，所以需要采取一定措施避免提前反应，比如说减少分区时间，预先添加引发剂等。

  核酸扩增系统的分区策略将是未来核酸检测中的一个主要发展方向，常用的两种分区策略是微室分区和液滴分区。与液滴分区相比，微室分区的数量和体积具有高度一致性。微室分区中现在通常选择压力驱动流体运动，但外界压力泵的使用会增加整体设备的不便，并且容易存在动力不稳定的情况，所以有选择采用芯片内置电源，通过压差使流体自动流入，或者通过离心使流体自动流入。而且微室和通道材料的亲水疏水性质也会影响流体流动和分布。

  在读取信号这一方面，杂质和其他自发荧光粒子的存在会对结果造成影响，但又不能被完全去除，所以有效过滤干扰信号的方法以及扩大目标信号表达的相关办法就非常重要。

  目前，CRISPR/Cas系统也被广泛用于核酸检测，通过降解已标记的核酸来产生荧光信号完成核酸检测。但是也存在一些问题，比如一些Cas效应蛋白如Cas9、Cas12a与crRNA复合物不仅要与靶标序列完全互补，而且需要一个额外的PAM或PFS区才可激活切割活性，限制使用；Cas13系统的核酸检测一般需要使用RNA作为荧光报告探针，但RNA容易降解，从而出现假阳性的检测结果，CRISPR/Cas用于核酸检测时还存在不能完全避免的脱靶效应，可能得到假阳性或假阴性的实验结果，影响检测的准确性。

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