作为冷链食品中最危险的致病菌之一，单核细胞增生李斯特氏菌（以下简称 “单增李斯特菌”）的检测一直是食品安全领域的重点。2025年实施的GB 4789.30-2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》 ，在旧版基础上进行了多项关键优化，更贴合当前食品行业的检测需求。今天，我们就从“标准修订亮点”、“全流程实操步骤”、“常见问题解答”三个维度，带大家吃透这份新国标，确保检测工作合规又精准。

GB 4789.30-2025有哪些关键变化？​

相较于2022版，新国标的修订并非 “小修小补”，而是从检测效率、准确性、适用性三个层面进行了升级，核心变化集中在以下3点：

1. 增菌体系优化：从“LB 肉汤”到“Fraser 肉汤”，选择性更强​

旧标准使用李氏增菌肉汤（LB1、LB2）进行两步增菌，但LB肉汤对杂菌（如葡萄球菌、肠球菌）的抑制效果有限，容易导致增菌后杂菌过多，干扰后续分离。​

新标原则采用Fraser增菌肉汤（FB1、FB2），通过添加萘啶酸、吖啶黄等选择性抑制剂，能更精准地抑制杂菌生长，同时为单增李斯特菌提供更适宜的营养环境，让目标菌在24-48小时内快速繁殖，大幅降低 “假阴性” 风险。​

2. 新增显色培养基：OA 平板让“致病菌”肉眼可见​

旧标准主要依赖PALCAM琼脂进行分离，但PALCAM琼脂上的单增李斯特菌菌落形态不典型（多为小而透明的菌落），需要结合后续生化试验才能初步判断，操作繁琐且耗时。​

新国标新增OA 李斯特氏菌显色培养基（全称“Oxford Agar基础+选择性添加剂”），单增李斯特菌在该培养基上会形成黑色中心、周围环绕透明晕圈的特征菌落（部分菌株晕圈可能延迟至48小时出现），肉眼即可快速识别，减少了对经验的依赖，分离效率提升50%以上。​

3. 鉴定流程简化：明确 “分子生物学方法” 的地位​

旧标准对分子生物学方法（如PCR）的提及较为模糊，仅作为“可选方法”。​

新国标则明确将实时荧光PCR法纳入“确证试验”范畴，规定若通过FB2增菌后，直接用单增李斯特菌特异性引物（如针对hlyA溶血素基因、inlA侵袭素基因）进行PCR扩增，且Ct值≤35，可直接判定为阳性，无需再进行繁琐的生化试验，检测周期从“5-7 天”缩短至“2-3 天”。​

一步步来：新国标下的检测全流程实操​

按照GB 4789.30-2025的要求，单增李斯特菌的检验分为“采样-增菌-分离-鉴定-结果判读”5个环节，每个环节都有明确的操作规范，缺一不可。​

环节 1：采样——“选对样品、做好无菌，检测就成功了一半”

采样是检测的基础，若采样不规范，后续再精准的方法也会“白费功夫”，新国标对采样的要求更强调“代表性”和“无菌控制”：​

（1）采样工具准备（必须无菌！）​

• 核心工具：无菌均质袋（建议选择带过滤膜的均质袋，方便后续取液）、无菌采样勺/镊子、一次性无菌手套、75%酒精棉片、0.85%无菌生理盐水（用于环境采样）、温湿度记录仪（记录样品运输温度）。​

• 关键提醒：所有工具需经121℃高压灭菌30分钟，或使用商业无菌包装产品；采样前需用酒精棉片对手套表面、采样袋开口处进行消毒，避免人为污染。​

（2）不同类型食品的采样要求​

（3）采样后处理（温度控制是关键）​

• 样品需放入带冰袋的保温箱（温度0-4 ℃），2小时内送至实验室；​

• 若无法及时送检，需在- 18 ℃以下冷冻保存，保存时间不超过24小时，解冻时需在4 ℃冰箱缓慢解冻（避免反复解冻导致细菌死亡）。​

环节 2：增菌 —— 严格按 “FB1→FB2” 两步走，温度不能错​

增菌是让“微量致病菌”达到可检测水平的核心步骤，新国标对增菌的温度、时间、转种量有明确规定，必须严格执行：​

（1）增菌（FB1）​

取25 g（或25 mL）样品放入无菌均质袋，加入225 mL FB1 增菌肉汤（按试剂盒说明配制，确保抑制剂完全溶解），用均质机以8000-10000 rpm/min振荡 30秒，然后置于30 ℃±1 ℃培养箱中培养24±2 小时。​

（注意：均质时需避免均质袋破裂，若样品含较多脂肪（如五花肉），可在均质后静置10分钟，待脂肪层浮起后取下层液体进行后续操作。）​

（2）增菌（FB2）​

从FB1增菌液中吸取0.1 mL（必须精确，不能多也不能少），转入装有10 mL FB2增菌肉汤的无菌试管中，再次置于30 ℃±1 ℃培养箱中培养24±2 小时。​

（注意：FB2肉汤的抑制剂浓度高于FB1，若转种量过多（如1 mL），可能导致单增李斯特菌被抑制，出现假阴性。​）

环节 3：分离——用OA显色平板，48小时内看“黑色菌落 + 晕圈”

分离的目的是从增菌液中挑出单增李斯特菌的纯菌落，新国标推荐优先使用 OA 显色培养基，操作步骤如下：​

（1）取FB2增菌液0.1 mL，用无菌涂布棒均匀涂布在OA显色平板上（每个平板涂1个样品，避免交叉污染）；​

（2）将平板倒置放入36 ℃±1 ℃培养箱，培养24-48小时；​

（3）观察菌落形态：​

• 典型菌落：黑色中心，周围有透明晕圈（24小时可能仅见黑色中心，晕圈需48小时才明显）；​

• 可疑菌落：无黑色中心但有晕圈，或有黑色中心但无晕圈（需进一步鉴定）。​

（注意：若OA平板上无典型菌落，需同时涂布PALCAM琼脂平板作为对照，避免因菌株差异导致漏检。​）

环节 4：鉴定——“生化试验”或 “PCR”二选一，新标都认可​

鉴定是确认“可疑菌落是否为单增李斯特菌”的关键，新国标提供两种方法，企业可根据自身条件选择：​

方法1：生化试验（传统方法，适合无PCR仪器的实验室）​

从OA平板上挑取3-5个典型菌落，分别接种到胰酪大豆胨琼脂（TSA）平板上，36 ℃培养24小时后，进行以下4项关键生化试验：​

方法2：实时荧光PCR法（快速方法，新标优先推荐）​

（1）取FB2增菌液1 mL，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA（确保去除蛋白质、脂肪等杂质，避免抑制PCR反应）；​

（2）配制PCR反应体系：2×PCR预混液10 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（10 μmol/L）0.2 μL、DNA模板2 μL、无菌水补至20 μL；​

（3）设置 PCR 程序：95 ℃预变性5分钟；95 ℃变性15秒，60 ℃退火延伸30秒，共40个循环，同时设置阳性对照（已知单增李斯特菌 DNA）和阴性对照（无菌水）；​

（4）结果判断：若样品的Ct值≤35，且阳性对照Ct值在20-30之间，阴性对照无Ct值，可直接判定为阳性。​

环节 5：结果判读与报告 —— 按新标格式，不能漏关键信息​

根据鉴定结果，新国标要求按以下标准出具报告，信息必须完整、准确：​

（1）阳性结果：

• 若生化试验全部符合单增李斯特菌特征，或PCR检测Ct值≤35，报告“25 g（或25 mL）样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌”；​

• 若进行定量检测（如液态乳制品），需通过MPN法（最可能数法）计算，报告 “每克（或每毫升）样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数为×× MPN/g（mL）”（MPN检索表见新标附录 B）。​

（2）阴性结果：

• 若OA平板无典型菌落，生化试验全部不符合，或PCR检测无Ct值，报告 “25 g（或25 mL）样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌”。​

（3）报告必备信息：​

样品名称、采样时间、采样地点、检测方法（需注明 “依据 GB 4789.30-2025”）、增菌培养基类型、鉴定方法、检测人员、审核人员签字。​

避坑指南：新国标检测中最容易出错的 3 个问题​

在实际操作中，很多实验室会因细节把控不到位导致检测结果不准确，结合新国标的要求，以下3个问题需重点规避：​

1. 增菌温度错误：把“30 ℃”调成“37 ℃”

很多人习惯用37 ℃培养细菌，但单增李斯特菌在30 ℃时生长速度最快，37 ℃反而会抑制其生长，导致增菌失败。​

✅解决办法：培养箱需提前校准温度，在培养期间每天记录温度，确保波动不超过±1 ℃。​

2. OA平板使用不当：未加选择性添加剂​

OA显色培养基需在基础培养基中加入萘啶酸、多粘菌素B等选择性添加剂，若忘记添加，杂菌会大量生长，覆盖单增李斯特菌的典型菌落。​

✅ 解决办法：配制时严格按试剂盒说明书操作，添加添加剂后需摇匀，避免局部浓度过高。​

3. PCR 模板污染：导致“假阳性”

PCR反应极其灵敏，若操作时未更换手套、移液器吸头交叉使用，或DNA提取过程中接触了阳性样品，会导致模板污染，出现假阳性。​

✅ 解决办法：设置独立的“样品制备区”“PCR 扩增区”，使用带滤芯的吸头，每次实验后用10%次氯酸钠擦拭台面。​

标准落地需要 “硬件 + 软件” 双配套​

要让GB 4789.30-2025真正发挥作用，食品企业和检测机构需做好两方面准备：​

• 硬件升级：配备30 ℃、36 ℃双温区培养箱（避免温度波动）、实时荧光PCR 仪（建议选择检测通道≥4 的型号，可同时检测多个基因）、均质机（转速需达标）；​
• 人员培训：组织检测人员学习新国标的修订要点，尤其是增菌体系和显色培养基的使用方法，定期开展实操考核，确保每个环节都符合规范。​

食品安全无小事，单增李斯特菌的检测更是 “防患于未然” 的关键。希望这份实操指南能帮助大家更好地掌握 GB 4789.30-2025，让每一份冷链食品都经得起检验，让消费者吃得放心！

（注：本文所有操作步骤均依据 GB 4789.30-2025，实际检测中需结合样品特性和试剂盒说明书调整，若有疑问可咨询当地疾控中心或第三方检测机构。）​