古老的东方智慧依然有效：与氯消毒相比，煮沸去除饮用水中的抗生素抗性基因

  细菌抗生素抗性是21世纪人类健康的重要威胁之一，作为抗生素抗性的遗传信息载体，抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)被定义为新型环境污染物。近年来，国内外研究在市政饮用水中普遍检出ARGs甚至抗性菌(antibiotic resistant bacteria，ARB)，凸显出饮用水细菌抗生素抗性问题的严峻。饮用水细菌抗生素抗性问题难以在水处理和给水过程中彻底解决，需要通过用户端消毒去除残留的ARGs以提高饮用水的生物安全性。本文系统评估了煮沸消毒对饮用水中抗性基因的去除效果并探讨了去除机制。通过与氯消毒对比，发现了煮沸消毒在应对抗性基因污染中的优势。      

摘要：城市饮用水中的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)在集中处理过程中可能无法有效去除。为了减少潜在的健康风险，有必要在用户端对水进行消毒。本研究调查了一种常用的家庭用水消毒方式-煮沸消毒方式的效果，以应对抗生素抗性基因的污染。我们发现，与氯消毒和巴氏消毒相比，煮沸在灭活大肠杆菌和环境细菌方面更有效。煮沸环境细菌悬浮液去除了比氯消毒(多达13个基因)更广泛的ARGs和可移动遗传元件(多达141个基因)，这种效果主要归因于对包括不动杆菌和芽孢杆菌在内的耐氯细菌更强的灭活。在相同处理时间(30 min)下，高温加热(≥ 90.1 ℃)对DNA结构的损伤比氯消毒(5 mg/L)更彻底。考虑到DNA融解后ARGs的低可转移性，煮沸可能是一种用来来降低饮用水中细菌ARGs的有效方式，仍值得在未来推广。

  引言

  煮沸可能是家庭层面上最古老的水消毒方式。在没有微生物概念的情况下，中国古人总结了喝开水不容易生病的经验。烧开水也植根于中国古代的茶文化，一直流传至今。尽管与某些替代品相比，烧开水消耗的能量相对较高，这限制了其在大规模集中式水处理中的应用潜力，但由于其良好的消毒性能和易于使用的优势，目前它仍然是在家庭层面上使用的最普遍的水处理方式。各国政府、非政府组织和其它机构都在促进烧开水，无论是在水微生物质量通常不确定的发展中国家，还是在常规水处理失败或供水中断的发达国家。然而，目前还不知道这样一种古老的东方智慧在处理新出现的污染物ARGs时表现如何。

  结果

  细菌灭活

  对大肠杆菌悬浮液(~108 cells/ml)和环境细菌悬浮液(~107 cells/ml)进行了消毒性能测试。如图1所示，氯消毒30 min可灭活3.14-7.13 logs的大肠杆菌和1.6-1.9 logs的环境细菌。氯化消毒对大肠杆菌灭活有显著的剂量-效应关系，但对环境细菌灭活无明显影响。与氯消毒相比，巴氏消毒在灭活大肠杆菌和环境细菌方面表现出更好的性能。低温巴氏消毒(60 ℃，30 min)后，可培养的大肠杆菌下降了6.95~7.25logs，高温巴氏消毒(75 ℃和90 ℃，10 min)几乎检测不到可培养的大肠杆菌，而不同温度巴氏消毒后，环境细菌下降了2.1~2.6 logs。与巴氏消毒和氯消毒相比，煮沸消毒效果最好，煮沸3min后，大肠杆菌全部灭活，环境细菌减少7.4 logs。延长煮沸时间显著提高了消毒效果，而改变加热强度对消毒效果的影响不大。

  图1 消毒前后HPC的变化。(a)大肠杆菌悬浮液和(b)环境细菌悬浮液。高加热强度意味着水温每分钟上升40℃，低加热强度意味着水温每分钟上升10℃。条形图为三次重复的平均值。误差棒表示重复数据的标准偏差。

  进一步分析消毒前后环境细菌悬浮液的细菌群落结构。消毒前共检测到1051个OTUs，经巴氏消毒、煮沸、氯消毒后分别降至259 ± 29个、247 ± 20个、225 ± 20个。在属水平上，未消毒菌悬浮液中检出16个优势属(相对丰度>1%)，其平均相对丰度为2.8%(图2)，经巴氏消毒、煮沸和氯消毒处理后，优势属分别减少到13个、11-12个和4-6个，平均相对丰度分别增加到6.5-7.0 %、7.1-8.4 %和15.6-23.4 %。

  图2 消毒前后优势属组成变化。这里的优势属定义为在任何样本中相对丰度大于1%的属。

  环境ARGs和MGEs去除

  对消毒前后的环境细菌悬浮液进行细菌抗生素抗性分析(图3)。对照组共检测到137个ARGs和7个可移动遗传元件(MGEs)，这些基因的丰度范围为5.76-9.89 logs copies/ml。煮沸1-15s后，ARGs和MGEs下降到1.95 logs。煮沸3min后，33~35个ARGs完全去除，残留基因被去除到2.09-4.22 logs。煮沸10分钟后只能检测到3-12个ARGs，它们的拷贝数下降到4.69-6.75 logs。在初始氯浓度为1 mg/L的条件下氯消毒30min，可使ARGs和MGEs达到1.33 logs。初始氯浓度为3 mg/L，氯消毒30min后，13个ARGs完全去除，残留基因去除到0.65~4.05 logs，当氯浓度增加到5 mg/L后，这一值增加到0.62~6.72 logs。与煮沸和氯消毒相比，巴氏消毒对ARGs和MGEs的去除影响不大。

  图3 热图显示消毒前后环境细菌悬浮液中ARGs绝对丰度(log copies/ml)的变化。高加热强度和低加热强度是指加热过程中水温每分钟分别上升40 ℃和10 ℃。

  细菌灭活过程中ARGs的释放

  抗生素抗性可以通过水平基因转移(HGT)在细菌之间传播。即使携带ARGs的细胞被杀死，释放到环境中的ARGs也有可能持续存在，并通过细菌接合被其它细胞获得。在这里，我们通过监测大肠杆菌消毒过程中细胞内和细胞外ARGs丰度的变化来评估ARGs的释放风险(图4)。

  我们发现，在低于80℃的加热和氯消毒的初始阶段都有ARGs的释放。据报道，热应激和氯消毒都会破坏细胞膜的完整性，导致细胞内DNA等物质的释放。流式细胞仪检测发现，60 ℃加热20 min可使通透性大肠杆菌细胞比例由0.13 ± 0.02 %增加到79.67 ± 0.68 %。

  图4 在加热、煮沸和氯消毒(初始氯浓度为1和5 mg/L)过程中，细胞内和细胞外基因(blaTEM、tetC和16S rDNA)丰度的变化。本消毒试验采用大肠杆菌悬浮液进行。各点为三次重复的平均值。误差棒表示重复数据的标准偏差。

  加热和氯消毒过程中的DNA损伤

  如图5所示，扩增子在531 bp处显示出明显的峰，峰高(Fu)与扩增子的DNA浓度高度相关。低温加热后(≤ 81.3 ℃)，531 bp处的峰高(Fu)保持不变但氯消毒后略有下降，表明低温加热不会影响DNA的完整性，而氯消毒会在一定程度上损害DNA的完整。我们发现高温加热(≥ 90.1 ℃) 导致531 bp处的峰高(Fu)显著下降，加热温度越高，峰高下降趋势越明显。这些结果表明，加热超过90 ℃可显著损伤DNA的双链结构。

  图5 加热(30 min)和氯化(5 mg/L)后扩增子DNA(浓度为3.29 ng/μl)的降解。a)基于Agilent 2100生物分析仪的DNA电泳分析;b)DNA分子大小分布，50 bp和17000 bp处的峰代表DNA标记，将其添加到测定中以标记大小为50 bp和18000 bp的DNA分子。

  结论

  为了减少饮用水中细菌抗生素抗性问题带来的潜在健康风险，用户端消毒对家庭层面来说是十分必要的。烧开水作为国内最常用的水处理方式，对其去除ARGs的性能进行了研究。在处理复杂的环境菌群时，煮沸在细菌灭活和ARGs去除方面表现出广谱性和高效性，明显优于氯消毒和巴氏消毒。低于80℃的加热会导致细菌细胞释放ARGs，但当水温高于90℃，细胞内和细胞外ARGs均被去除。这一发现也突出了低温巴氏消毒(<80℃) 可能会促进BAR的传播。原则上，高温去除ARGs是通过DNA变性实现的，它可以有效降低DNA的生物活性并降低HGT的风险。虽然烧开水在能量上不经济，但在去灭活ARB和去除ARGs方面更为彻底。相信随着能源技术的进步，烧开水这一东方饮用水消毒传统方式在未来仍值得推广。

  参考文献

  Wan K, Zheng S, Ye C, et al. Ancient Oriental Wisdom still Works:Removing ARGs in Drinking Water by Boiling as compared to Chlorination. Water Res. 2021;209:117902. doi: 10.1016/j.watres.2021.117902