羊布鲁氏菌 Rev.1 是一种减毒活疫苗株，广泛用于控制小型反刍动物的布鲁氏菌病。对于成功的监测和控制计划，布鲁氏菌分离株的快速鉴定和表征以及接种疫苗和自然感染动物的可靠区分是必不可少的先决条件。尽管 MALDI-TOF MS 越来越多地应用于临床微生物实验室诊断布鲁氏菌病，但通过这种方法进行物种甚至菌株分化仍然是一个挑战。

  为了检测能够区分羊布鲁氏菌Rev.1减毒株与野生株的生物标志物，该研究团队最初通过计算机比较羊布鲁氏菌 Rev.1 和 布鲁氏菌16M 的蛋白质组来寻找具有特异性的标记蛋白。由此发现了羊布鲁氏菌16M 的 113 个蛋白质序列，揭示了羊布鲁氏菌Rev.1在注释中的同源序列，其中 17 个序列产生了潜在的生物标志物。随后分析了 18 个羊布鲁氏菌Rev.1 疫苗和 183 个以色列羊布鲁氏菌野生株的 MALDI-TOF MS 图谱，以验证已识别的候选标记物。这种方法可检测到两个布鲁氏菌属独特的生物标志物，其特性与核糖体蛋白 L24 和 S12 最为相似。这两种蛋白质可将羊布鲁氏菌Rev.1 与密切相关的羊布鲁氏菌16M 和以色列羊布鲁氏菌野生株区分开。

  此外，该研究团队使用一组来自不同来源和不同 MLVA 类型的羊布鲁氏菌菌株验证了它们的区分能力。根据研究结果，建议将 MALDI-TOF MS 分析作为一种快速、经济高效的替代方法，以替代传统、耗时的方法，以在菌株水平上区分某些羊布鲁氏菌分离株。

  1、通过生物信息学分析筛选生物标记物

  图1比较了两个16M 基因组 (GCF_000007125.1: 3317 CDS; GCF_000740415.1: 3297 CDS) 和一个 Rev.1 基因组(GCF_002953595.1: 3299 CDS) 的蛋白质编码序列集。由此产生的 17 种潜在生物标志物对的候选名单(表 1)由 3 种假设的蛋白质、具有管家酶特性的蛋白质和 50S 和 30S 核糖体亚基的 5 种蛋白质(L24、L6、S12、S8、S7)组成。 而核糖体蛋白在细菌细胞中含量很高，是 作为MALDI-TOF MS 鉴定和分类细菌的著名生物标志物。

  图1 在 RASTtk 注释的基因组中发现的共享和独特蛋白质序列的维恩图

  2、核糖体蛋白L24和S12为鉴定Rev.1的潜在蛋白标记物

  经对17种潜在标记物分析后发现，只有L24和S12两种蛋白标记物能完全区分减毒株Rev.1和布鲁氏菌16M。如图2所示，L24蛋白分别位于减毒株Rev.1 的m/z 11178以及布鲁氏菌16M菌株的m/z 11208位置上;S18蛋白分别位于减毒株Rev.1 的m/z 13887.2以及布鲁氏菌16M菌株的m/z 13871.2位置上。因此，可以通过用MALDI-TOF MS检测以上两种蛋白，便可分区减毒株Rev.1和常规羊布鲁氏菌16M。

  图2 羊布鲁氏菌16M与Rev.1菌株之间的峰值比较

  3、结论

  布鲁氏菌中的天然链霉素抗性很少见，因此，链霉素是一种临床用于治疗布鲁氏菌的抗生素之一。但体外观察发现，布鲁氏菌已从对链霉素表现出不同程度的敏感性向“自发抗性”发展。分离株编码的核糖体蛋白S12，具有链霉素抗性等位基因的氨基酸序列。而基于 MALDI-TOF MS 的筛选方法，Rev.1 减毒株和其他具有核糖体蛋白 S12 变体的链霉素抗性野生分离株可能有助于降低人类布鲁氏菌病一线治疗不足的风险。

  参考文献：

  [1] Kornspan D , Brendebach H , Hofreuter D , et al. Protein Biomarker Identification for the Discrimination of Brucella melitensis Field Isolates From the Brucella melitensis Rev.1 Vaccine Strain by MALDI-TOF MS[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12:3132-.