1.肺炎克雷伯菌生物膜对噬菌体感染产生了表型抗性

在微流体系统中培养肺炎克雷伯菌生物膜(图1A)。当生物膜达到约500 μm时，我们用低滴度的噬菌体Kp11处理生物膜。1h后发现生物膜边缘的少数局部区域被噬菌体感染示(图1B)。而未经噬菌体处理的生物膜中只有少量细胞死亡。约2h后，观察到生物膜大量溶解，生物膜停止生长(图1、B和C)。约10h，生物膜恢复生长，生长速度明显低于感染前（图1C）。切换到含有高滴度Kp11的培养基中，生物膜生长速度没有受到影响，这表明生物膜获得了对Kp11的抗性(图1C)。当噬菌体感染后生物膜恢复生长时，整个生物膜的生长是均匀的(图1D)。

图1：肺炎克雷伯菌生物膜噬菌体感染的时空动态

测定在生物膜均匀再生过程中产生的细菌是否对噬菌体具有抗性。用Kp11处理生物膜，直到它们均匀再生。结果发现一小部分(<3%)分离的细菌对Kp11具有耐药性(图2B)。这些耐药细菌很可能是自发产生的突变体，因为从未用噬菌体处理过的生物膜中分离出一小部分耐药细菌。由于耐药菌的百分比远低于均匀再生时产生的细菌百分比(16.61 ~ 58.49%)(图2B)，因此认为均匀再生是由于生物膜形成的表型抗性。

图2：噬菌体尾部纤维蛋白使生物膜抵抗噬菌体感染

2.噬菌体尾部纤维使生物膜对噬菌体感染具有抗性

注意到噬菌体感染后，在生物膜的相衬图像中出现一条明亮的条带，并且随着感染的进展，条带向生物膜内部移动(图2C，用红色箭头表示)。为了解这是否与生物膜的抗性有关，首先测试它是否由噬菌体扩散到生物膜中引起。用荧光染料FITC标记Kp11，并用标记的噬菌体处理生物膜。发现FITC荧光只能穿透~60 μm进入生物膜外围(图2、D、E)，证实标记的噬菌体正常感染细菌，噬菌体的渗透仅限于生物膜的外围区域，而条带是由其他分子的扩散引起的。为探究这是否由噬菌体复制的未组装成分引起，发现纯化后的噬菌体尾部纤维蛋白gp46可以在生物膜中诱导出相同的条带(图2F)。用gp46处理3小时后，生物膜对高滴度^{(107 PFU/ml)}的噬菌体产生耐药性(图2G)。这些结果表明，噬菌体感染后出现均匀再生是由于裂解细菌释放的游离gp46。

3.噬菌体尾部纤维穿透生物膜，降解细菌囊

许多噬菌体使用它们的尾部纤维先与荚膜结合，然后降解荚膜，而荚膜的结合和降解对于感染的开始都是必不可少的(图3A)。将mCherry融合到其尾纤维蛋白gp46的N端，发现其在野生型细菌表面积累，但在荚膜缺陷菌株ΔwcaJ上没有积累（图3B）。随着时间的推移，荧光逐渐减弱，并在25分钟内消失(图3C)，通SDS-PAGE凝胶分析，证实gp46确实具有解聚合酶活性。构建一个不具有解聚合酶活性的突变体gp46 (gp46mut)，发现它在被包裹的细菌表面稳定积累(图3C)，但在ΔwcaJ菌株表面不稳定积累。这些结果表明，gp46特异性结合到细菌表面的荚膜上，降解荚膜，降解后从细菌中释放出来。

图3：噬菌体尾部纤维蛋白在生物膜中的作用

4.调整尾部纤维或胶囊水平改变了生物膜对噬菌体的抵抗力

基于以上结果提出抗性在生物膜中产生的机制如图4A。由于细菌的密集包装，噬菌体向生物膜的扩散受到限制。因此，噬菌体感染从生物膜外围开始，逐渐向生物膜内部发展。在噬菌体复制过程中，未组装的尾纤维蛋白在细菌裂解时被释放到生物膜中。这些尾部纤维蛋白附着在被包裹的细菌表面，降解胶囊，降解后与细菌分离，然后再次附着在其他被包裹的细菌上。通过这一过程，尾部纤维蛋白促进自身渗透到生物膜中，导致胶囊丢失在生物膜中扩散。由于噬菌体感染的开始需要与荚膜特异性结合，因此荚膜的丢失导致了对噬菌体的抗性和生物膜的均匀再生。这一机制表明，改变游离gp46的水平会影响生物膜耐药性。具体而言，增加/减少游离gp46水平会导致噬菌体感染后胶囊降解速度更快/更慢，从而导致生长恢复速度更快/更慢。通过验证表明确实如此（图4）.

图4：生物膜对噬菌体的抗性机制

5.尾纤维的作用在抗菌膜策略的制定中具有重要意义

生物膜是感染的主要原因，通常对抗生素和宿主免疫具有耐药性。本研究结果可以为开发噬菌体对抗生物膜的策略提供指导。尾纤维对荚膜的降解可能具有重要的意义，甚至可能开辟更多的可能性。噬菌体治疗的常见做法是将噬菌体与抗生素结合使用。由于荚膜可能影响抗生素对细菌的渗透，测定了胶囊对各种抗生素疗效的影响。结果表明（图5），在噬菌体与抗生素联合使用时，考虑细菌裂解液的影响是很重要的。

图5：噬菌体对抗生物膜的意义

参考文献：

Qianyu Hu et al. ,Essential phage component induces resistance of bacterial community.Sci. Adv.10,eadp5057(2024).DOI:10.1126/sciadv.adp5057