一、背景

在临床研究中，疾病相关的肠道环境改变(如生态失调)已被报道与急性移植物抗宿主病（aGVHD）症状密切相关。在生态失调状态下，一些共生菌获得致病特性，增殖并直接参与疾病的发生和发展。肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌，是在患者中检测到的代表性病原体。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)是多重耐药感染的主要原因，也是异基因造血干细胞移植（allo- HCT）患者血流感染的主要原因。因此，消除allo-HCT患者肠道中的肠球菌是至关重要的。噬菌体治疗被认为是一种消除病原体的有效替代方法，因为噬菌体能特异性地感染其宿主细菌导致细菌死亡。这篇文章中，提出了一种使用杀菌酶-内溶素抑制肠球菌相关aGVHD的策略。

二、研究方法

本研究首先从接受异体造血细胞移植的患者中收集粪便样本，通过16S rRNA基因测序分析肠道微生物组成，发现Enterococcus属细菌在肠道中的优势与急性移植物抗宿主病的发生密切相关。随后，研究人员从这些患者样本中分离出E. faecalis细菌，并在实验室条件下培养，发现这些细菌通过形成生物膜在肠道中存活和增殖。通过全基因组测序和生物信息学分析，研究团队从E. faecalis特异性噬菌体中鉴定出一种新的溶菌酶，这种溶菌酶能够在体外和体内裂解E. faecalis生物膜。最后，通过在无菌小鼠模型中重建肠道微生物群，并使用溶菌酶进行治疗，证实了溶菌酶能够减少肠道中E. faecalis的数量，并显著提高患有急性移植物抗宿主病的小鼠的存活率，从而证明了这种溶菌酶治疗策略对预防和治疗aGVHD具有潜在的临床应用价值。

三、研究结果

1、肠球菌在 allo-HCT患者肠道中的优势

先前的研究表明，肠球菌在肠道中占据优势地位，并且与异基因造血干细胞移植患者急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发生以及更高的死亡率有关。因此，本研究进一步探索了肠球菌在肠道中的定植情况。研究共收集了46例患者的317份粪便样本，提取所有样本的DNA，并通过16S核糖体RNA（rRNA）基因测序分析了其肠道微生物组成。结果显示，在30例（65.2%）患者的89个样本中发现肠球菌占据优势，这与先前的研究结果相一致。

2、粪肠球菌的生物膜形成

接下来，从粪便样本中通过PCR检测分离出30株肠球菌，其中11株为粪肠球菌，19株为屎肠球菌。对这30株肠球菌进行了抗菌药敏试验，结果显示所有粪肠球菌和屎肠球菌菌株均对万古霉素、氨苄西林等抗生素敏感，表明这些菌株的耐药性并不是由耐药基因引起的，可能有一些其他的机制。细胞溶素（cytolysin，一种与溶血相关的外分泌蛋白）是人类肠球菌致病的重要因素。因此接下来探索了肠球菌中细胞溶素基因的表达情况。结果表明在所有粪肠球菌菌株中检测到了细胞溶素相关基因（如cylI、cylA、cylB和cylM），但在屎肠球菌菌株中未检测到。此外，所有细胞溶素阳性的粪肠球菌菌株都具有功能性溶血活性，屎肠球菌是没有功能性的溶血活性的，与基因表达情况一致。这说明粪肠球菌在allo-HCT患者的发病过程中占主导地位。然后通过KEGG和KO分析发现，与生物膜形成相关的基因（如geLE,wecB,tagA）在粪肠球菌中的检测频率更高。生物膜形成的细菌对抗生素的耐药性是浮游状态细菌的10到1000倍，之前也证明了菌株的耐药性并不是由耐药基因引起的，因此推测粪肠球菌可能通过在allo-HCT患者的肠道中形成生物膜来存活和增殖，从而抵抗治疗过程中使用的各种抗生素。

3、一种噬菌体衍生的抗菌酶

生物膜通过降低抗生素的渗透性、隔离抗生素等机制，对抗生素具有极强的抵抗力。因此，使用现有抗生素消灭粪肠球菌是非常困难的。由于在之前的研究中，作者成功地从鉴定出艰难梭菌前噬菌体序列中鉴定出一种新型内溶素，这种内溶素在体外和体内对艰难梭菌都具有杀菌活性。因此，希望找到一种内溶素，能够破坏粪肠球菌的生物膜并起到杀菌作用。然后从粪肠球菌前噬菌体序列中提取了含有内溶素的病毒的完整序列，并且通过Western blotting表达和纯化了内溶素。在体外试验中，这种内溶素表现出了显著的裂解活性，与空载体相比，能够显著减少粪肠球菌的数量。此外，内溶素成功裂解了所有粪肠球菌菌株的生物膜。但是内溶素对其他肠道细菌（如表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）没有显著的裂解活性，表明其具有特异性作用。此外，在粪肠球菌单独定植的C57BL/6小鼠模型中，口服内溶素能够有效溶解肠内的粪肠球菌生物膜。这些研究表明，无论在体外还是体内，内溶素都能有效溶解粪肠球菌形成的生物膜。

4、内溶素对aGVHD的抑制作用

接下来，他们使用内溶素或空载体分别治疗移植后发生aGVHD小鼠。结果发现，内溶素治疗能够显著降低小鼠粪便中的粪肠球菌水平，并有效提高 aGVHD小鼠的生存率。这些发现表明，粪肠球菌来源的内溶素可以通过减少肠道中粪肠球菌的数量来调节aGVHD的进程。为了进一步验证这一效果，我们对以肠球菌为主的人类粪便样本定植的C57BL/6小鼠模型（诱导产生GVHD）进行了研究。结果显示，在移植前后，两组小鼠的肠道微生物群落之间并无显著差异。然而，内溶素处理的小鼠血清中干扰素γ（IFNγ）的水平显著降低，且小鼠的生存率显著延长。综上所述，这些数据表明，从宏基因组数据中检测到的粪肠球菌前噬菌体序列编码的内溶素对aGVHD具有潜在的临床应用价值。

四、研究结论

在本研究中，从粪肠球菌的前噬菌体测序数据中鉴定出一种具有裂解能力的内溶素。该内溶素能够有效裂解形成生物膜的粪肠球菌，并在体内外实验中成功根除肠道中的粪肠球菌，进而抑制aGVHD的恶化，为aGVHD的治疗提供了新的策略。

内溶素具有宿主特异性高、裂解速度快、耐药风险低、与不同的抗菌剂协同作用的特点，并能在生物膜和粘膜表面发挥作用，为治疗其他生物膜形成细菌提供了新策略。

噬菌体来源的内溶素还可能在与粪肠球菌相关的其他难治性感染中发挥重要作用，如肝病和感染性心内膜炎，为新型治疗方法的开发提供了新的方向。

参考文献

Fujimoto K, Hayashi T, Yamamoto M, Sato N, Shimohigoshi M, Miyaoka D, Yokota C, Watanabe M, Hisaki Y, Kamei Y, Yokoyama Y, Yabuno T, Hirose A, Nakamae M, Nakamae H, Uematsu M, Sato S, Yamaguchi K, Furukawa Y, Akeda Y, Hino M, Imoto S, Uematsu S. An enterococcal phage-derived enzyme suppresses graft-versus-host disease. Nature. 2024 Aug;632(8023):174-181. doi: 10.1038/s41586-024-07667-8 PMID: 38987594.