深度挖掘宏基因组模式改造噬菌体

噬菌体可以通过重组或趋同进化改变基因序列及其对应的蛋白质模体（英文为Motif，小编读下来意思是指比蛋白质结构域氨基酸数量更少的肽段）来适应新的宿主。然而哪些蛋白质模体能用于噬菌体进化，不同的进化素材能赋予噬菌体怎样的生存优势，依然是未知的。

近日，来自威斯康星州大学麦迪逊分校的Karthik Anantharaman团队在《bioRxiv》上发表研究“Engineering bacteriophages through deep mining of metagenomic motifs”报道了一种称为 Meta-SIFT （Metagenomic Sequence Informed Functional Training） 的新方法，用于发现宏基因组数据集中可以改变噬菌体活性的基因序列及其蛋白质模体。并以改变T7噬菌体的宿主侵染效率、侵染对象为目标验证了Meta-SIFT的性能。

细节如下：

Meta-SIFT 是一种基于生物信息学的蛋白质模体检索工具，它使用来自深度突变扫描 （deep mutational scanning，DMS） 的实验数据来识别影响噬菌体活性的宏基因组序列及其对应的蛋白质模体。

Meta-SIFT算法的开发主要基于三方面考量：

1、相关的基因序列及其衍生蛋白质模体可能隐藏在宏基因组中，与原始噬菌体蛋白几乎没有序列同源性。

2、对噬菌体活性有显著影响的宏蛋白质模体可能与噬菌体自身具备的蛋白质模体没有相似之处。

3、由于蛋白质模体赋予噬菌体的活性与蛋白质模体在噬菌体整体结构上的分布关系密切，需要确定最适合的插入蛋白质模体的位置以实现蛋白质模体的性能最大化。

为了对用 Meta-SIFT 进行性能评估，研究使用 Meta-SIFT 从宏基因组数据库中挖掘了 可用于T7 噬菌体受体结合蛋白（receptor binding protein ，RBP）的蛋白质模体。

先用DMS 数据确定每个位置每个可能替换的“种子分数”。种子分数是根据噬菌体中每个位置的不同氨基酸替换后对噬菌体侵染宿主范围的可能影响生成的，如果该替换导致宿主范围发生变化，则种子评分会增加，这表明替换的位置或种类对于改变噬菌体活性至关重要。

在编译了从种子评分得出的候选蛋白质模体列表后，Meta-SIFT 挖掘了NCBI数据库的宏基因组数据集以匹配序列。简单起见，研究将替换模体的大小限制在了 6聚体和 10聚体（6个aa与10个aa）蛋白质模体上，搜索产生了 15,561 个 6 聚体和 3,549 个 10 聚体蛋白质模体。将所有 19,109 个蛋白质模体合成为芯片寡核苷酸，并将蛋白质模体插入尖端蛋白质模体种子评分高的位置。使用 ORACLE （Optimized Recombination， Accumulation， and Library Expression） 将变异文库插入到 T7 噬菌体基因组中。ORACLE 是一种高通量、精准的噬菌体基因组工程工具，旨在创建一个大型、无偏倚的具有定义序列组成的噬菌体变体文库。

随后使用了20种大肠杆菌宿主来评估替换的结果，让噬菌体突变文库在每种大肠杆菌宿主上增殖两个周期后评估丰度占比，得到了 4,328 个变体在所有20种宿主上都具备侵染活性。

对所有突变序列进行统计分析发现，单个氨基酸突变在大肠杆菌10G（大肠杆菌亚种名） 上产生的功能性噬菌体变体不到 40%，而该文库中的变体在选择后每个序列包含大约 5 个（对于 6 聚体蛋白质模体）或 9 个（对于 10 聚体蛋白质模体）突变。这些结果表明 Meta-SIFT 发现了 位于RBP 蛋白上的、可以容忍的高比例随机突变序的蛋白质模体位置，该位置能够赋予噬菌体适应性益处。

产志贺毒素大肠杆菌 （Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC） O121 是大肠杆菌的 6 个非 O157 血清型之一，是一种致病大肠杆菌，在高盐（2% NaCl）条件下，该宿主对野生型噬菌体和 DMS 文库完全耐药。因此，设计针对该宿主的、高盐条件下具有活性的噬菌体是一项新的挑战，因为提高活性的组合解决方案在序列空间中与野生型序列相距太远，无法存在于噬菌体种群的自然多样性中。利用Meta-SIFT进行筛选后，认为GGIARA（变体 1 - S475G、S477I、G479R、G480A）从位置 475 到 480 和 IARTGS（变体 2 - S477I、G479R、G480T、V482S）从位置 477 到 482能赋予T7噬菌体在高盐条件下侵染O121的能力，但相对的，突变序列降低了低盐条件下的噬菌体侵染能力。总之，Meta-SIFT 可以针对高度表征的蛋白质模体进行针对性的配体检索，且其检索范围可跨物种。