期刊及年份：Cell，2022年5月

通讯作者: Jerry A. Nick，美国科罗拉多州丹佛市，国家犹太健康中心（National Jewish Health）医学部、科罗拉多大学医学院（University of Colorado School of Medicine）肺病专家，专注于成人囊性纤维化和支气管扩张症。

摘要：两名患有治疗抵抗性脓肿分枝杆菌肺部感染和严重囊性纤维化肺病的男性通过静脉接受了两种结核菌噬菌体的治疗。这些噬菌体经过工程改造，增强了它们溶解脓肿分枝杆菌的能力，并且被特别挑选出来针对该患者的细菌分离株最为有效。在出于同情使用的情况下，通过结合分子和代谢检测以及临床评估，观察到了噬菌体诱导的裂解作用的证据。治疗前后的脓肿分枝杆菌分离株显示出遗传稳定性，多样性普遍下降，并且没有对噬菌体或抗生素产生增加的抗性。针对一种噬菌体的抗噬菌体中和抗体滴度随时间增加，但并未阻止整个治疗过程中的临床改善。该受试者在第379天接受了肺移植，系统培养移植出的肺没有检测到脓肿分枝杆菌。本研究描述了在晚期肺病中成功进行的M. abscessus噬菌体治疗的过程和相关标志物。

主要内容

噬菌体（phages）是选择性地感染细菌并能以裂解方式复制，导致细菌死亡的病毒。裂解性噬菌体越来越被评估用于治疗难以治疗的感染。脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）是一种非结核分枝杆菌（NTM），具有高水平的内在和获得性抗生素抗性，这限制了治疗选择并导致预后不佳。尽管M. abscessus已被引用为噬菌体治疗的一个潜在重要靶标，并且是非结核分枝杆菌感染中被推荐进行噬菌体治疗的最常见类型之一，但自2019年一份病例研究报告描述了肺移植后治疗播散性M. abscessus亚种massiliense感染以来，关于其应用的报告寥寥无几。  

患有囊性纤维化（pwCF）的人群是最容易受到非结核分枝杆菌（NTM）肺病影响的群体。与典型的囊性纤维化（CF）气道病原体相比，脓肿分枝杆菌感染与肺功能更快速的下降有关，如果治疗无效，则成为肺移植的禁忌。在晚期CF肺病中，由于肺部结构的变化，特别是出现空洞、密集实变和肺实质塌陷的区域，可能会限制抗菌药物的治疗效果。M. abscessus还已知能在CF气道内形成生物膜。在受损肺内的微小环境中，分枝杆菌可能通过转变为一种不复制的“持留菌”状态，在没有氧气或营养的情况下存活较长时间，这可能会进一步抵抗常规的抗菌剂和宿主防御机制。

与抗生素治疗相比，噬菌体治疗CF气道中的M. abscessus感染面临着相似和独特的挑战。M. abscessus的临床分离株对噬菌体的敏感性差异很大，因此需要为每位患者个性化选择治疗性噬菌体。此外，大多数感染M. abscessus的噬菌体属于温和型，具有整合进细菌基因组的能力，必须经过工程改造以实现裂解而非溶原行为。与M. abscessus密切相关的菌系以及其他NTM物种的共感染，增加了选择出更具噬菌体抗性的菌株的可能性，尽管在M. abscessus中噬菌体抗性的发生相对较少。针对噬菌体的中和抗体的发展也可能强烈地抵消治疗效果。在更广泛的疾病背景下，如果实现了对M. abscessus的大量杀灭，由此产生的生态位可能会被其他机会性病原体占据。  

预先存在的细菌感染，最常见的是铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus），降低了气道培养物检测M. abscessus的敏感性，并可能掩盖成功治疗的临床反应标志物。鉴于CF气道中NTM培养物的相对低敏感性，需要改进不依赖培养的治疗反应标志物来评估疗效和治疗终点。在CF肺病中针对P. aeruginosa、S. aureus和Burkholderia dolosa的噬菌体治疗经验已经展示了改善的案例，但没有明确的根除目标感染的证据。在某些情况下，噬菌体治疗导致了噬菌体抗性和抗生素抗性分离株的出现，以及新病原体的产生。

在本研究中，我们描述了对一位年轻的囊性纤维化患者和脓肿分枝杆菌子种脓肿分枝杆菌肺部感染的同情使用，该感染对强化多药抗生素治疗无反应。在整个感染期间，包括噬菌体治疗前后，广泛收集和生物银行化保存的分离株和临床样本，使我们能够深入评估噬菌体治疗对CF肺部M. abscessus感染的影响。

晚期CF肺病中治疗抵抗性M. abscessus感染的临床表现

这位26岁的男性囊性纤维化患者（基因型H199Y/2184insA），患有严重的支气管扩张症、脓肿分枝杆菌肺病，以及对多种药物耐药的铜绿假单胞菌（MDR P. aeruginosa）和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的慢性肺部感染。五年前，他曾成功治疗过肺结核分枝杆菌（M. avium）感染，此后无复发迹象。成年后，他的临床病程以频繁的肺部加重为特点，需要住院并接受静脉（i.v.）抗生素治疗。  

2016年5月（噬菌体治疗开始前1582天），该患者的痰液培养首次检出带有完整erm(41)基因的脓肿分枝杆菌子种脓肿分枝杆菌阳性。在接下来的一年里，反复的阳性培养和咳嗽加剧、肺功能加速下降、肺部加重频率增加和放射学检查结果恶化的临床表现符合非结核分枝杆菌肺病的标准（图1A和1B）。在这次感染期间，他69个（共71个）的M. abscessus分离株只表现出粗糙的菌落形态。他在第1236天开始接受四种药物治疗（图1D）。在随后的4.7年里，他一直使用四到五种药物，这些药物会根据药物的可用性、敏感性测试、副作用的耐受性和治疗反应进行轮换。在他频繁的住院期间，这种NTM治疗方案被调整，以便同时治疗P. aeruginosa和MRSA，尽管他从未同时使用少于四种药物来对抗M. abscessus。

尽管进行了强化治疗，参与者的M. abscessus子种脓肿分枝杆菌培养结果持续呈阳性，放射影像特征恶化，肺功能下降，这表明缺乏微生物学反应（图1A和1B）。在噬菌体给药前的12个月内，他需要住院11次，每次住院时间从11天到21天不等（图1C）。由于缺乏治疗顽固性M. abscessus肺病的治疗选择，他曾被三个独立的肺移植项目拒绝进行肺移植。

图1. 从估计的最初感染时间到噬菌体治疗第500天的临床总结。临床参数以天数为单位绘制，初始噬菌体给药标记为第0天。(A) 气道培养结果（n = 155）用红色条形图表示（阳性M. abscessus，n = 71），蓝色条形图表示（阳性M. avium，n = 3），或灰色条形图表示（阴性培养，n = 82）。移植前的培养（第379天）来自咳出的痰液，移植后的培养来自BAL。(B) 1秒用力呼气量（FEV1，预计百分比）与天数绘制对比。(C) 住院情况（黑色水平线）与天数绘制对比。(D) 治疗过程。针对M. avium或M. abscessus的各种抗生素（水平线）的类型和持续时间绘制对比。药物使用顺序从最近到最早：（1）艾来卡夫托/特扎卡夫托/伊瓦卡夫托（E/T/I），（2）亚胺培南-西拉司丁-瑞来巴坦（IMI-REL），（3）阿莫西林，（4）奥马环素，（5）贝达喹啉，（6）头孢噻肟，（7）头孢他啶，（8）替加环素，（9）氯法齐明，（10）亚胺培南，（11）阿米卡星，（12）替地唑或利奈唑（口服或静脉注射），（13）乙胺丁醇，（14）利福平，和（15）阿奇霉素。(E) 最初感染的时间框架。基于分歧日期分析的最常见最近共同祖先的估计日期为噬菌体治疗前第-2494天（棕色圆圈），95%最高后验密度（HPD）区间从第-1945天到第-3435天（棕色条形图）。(F) 噬菌体治疗开始后的累积气道阴性培养数量。随时间变化的阴性培养发生情况绘制对比，针对M. abscessus（阴性培养红色圆圈，阳性培养红色方块），P. aeruginosa（阴性培养绿色圆圈，阳性培养绿色方块），和MRSA（阳性培养灰色圆圈，阴性培养灰色方块）。与P. aeruginosa或MRSA相比，M. abscessus的阴性培养比例更高（通过Fisher精确检验，p = 0.007）。(G) 对移植肺组织进行M. abscessus的系统分析。使用细菌培养对常规CF病原体（细菌Cx），抗酸杆菌染色，NTM培养（NTM Cx），和针对M. abscessus DNA的种特异性qPCR（MAB qPCR）分析了左上叶（LUL），左下叶（LLL），右上叶（RUL），右中叶（RML），右下叶（RLL），右主支气管（RMB），和左主支气管（LMB）的支气管分泌物，BAL，均质组织和组织病理学。阳性结果用P. aeruginosa（绿色框）表示，M. avium（蓝色框）或M. abscessus（红色框）。阴性结果用白色框表示，未进行的检测用划掉的框表示。另见图S1和S5。  

早期感染中分离出的M. abscessus的完整基因组

在噬菌体治疗前1555天（即“-1555”样本）收集的一个分离株被测序，以提供一个早期时间点分离株的完整基因组。长读长和短读长被组装成一个5,018,523碱基对的环状染色体。完整的基因组包含了涉及对一般抗生素（mdtH、stp、sugE）和特定抗生素如β-内酰胺类（penP）、异烟肼和乙胺丁醇（iniA）、双环霉素（bcr）、阿霉素（drrA）、磷酸霉素（fsr）和四环素（tetA）的抗性基因，这是该物种的典型特征（Seemann，2014）。该基因组不包含完整的原噬菌体，也没有检测到质粒。

鉴定对M. abscessus有效的噬菌体

从噬菌体治疗前1437天（图2A）收集的痰液中培养出的M. abscessus分离株，通过噬菌斑试验筛选对一系列噬菌体的敏感性。这个M. abscessus噬菌体治疗前1437天的分离株对两种宿主范围突变体（HRMs）敏感，这两个突变体是经过改造的裂解性噬菌体BPs的衍生物（即BPsD33HTH_HRM10和BPsD33HTH_HRMGD03，图2A）。这种改造去除了抑制基因的一部分，使它们具有裂解性。噬菌体D29是一个裂解性噬菌体，归类在A组，被认为是一个亲代温和噬菌体的自然发生的衍生物；D29_HRMGD40是D29的一个HRM，它在M. abscessus菌株GD40上被分离出来，与D29亲本不同，它能感染几种M. abscessus临床分离株。M. abscessus噬菌体治疗前1437天的分离株通过与BPsD33HTH_HRM10和D29_HRMGD40单独或联合孵化，在广泛的细菌和噬菌体浓度范围内被有效杀死（图2B）。在将噬菌体治疗前1437天的分离株的108个菌落形成单位（CFUs）分别用任一种噬菌体单独或两种噬菌体一起挑战，感染多重性（MOI）为10时，恢复了2至6个存活的菌落（图2B），但所有菌落在重新测试时都被发现对两种噬菌体完全敏感（图2C和2D）。因此，噬菌体BPsD33HTH_HRM10和D29_HRMGD40被选为治疗性噬菌体混合物，按照之前描述的方法进行扩增和纯化，达到了高滴度，并被证明是无菌和无内毒素的。  

图2. 噬菌体治疗没有选择出噬菌体耐药菌株。(A) 在噬菌体治疗开始前1,437天、323天和60天，以及治疗开始后5天、44天和245天，对M. smegmatis mc2155和六个M. abscessus菌株进行噬菌体平板效率测试。噬菌体裂解物进行了10倍连续稀释，并点样到每种菌株的顶层琼脂上。噬菌体BPD33HTH_HRMGD03、BPD33HTH_HRM10、Muddy、Itos、D29和D29_HRMGD40对每个M. abscessus菌株的感染效率与M. smegmatis mc2155相似。之前用于治疗的噬菌体BPD33HTH_HRM10（Dedrick等人，2019年，2021b），以及D29_HRMGD40被选为治疗候选；噬菌体Itos能有效感染M. abscessus菌株，但杀伤效果不佳。(B) 使用BPD33HTH_HRM10、D29_HRMGD40或两种噬菌体共同作用，杀死在噬菌体治疗开始前1,437天收集的M. abscessus菌株。每个柱状图代表菌株的10倍连续稀释（左列，2×10^5 CFU），每一行代表BPD33HTH_HRM10（顶行，10^9 PFU）、D29_HRMGD40（顶行，10^7 PFU）或两种噬菌体的10倍连续稀释。(C) 生存测试显示，使用BPD33HTH_HRM10或D29_HRMGD40或两者共同作用，有效杀死在噬菌体治疗开始前1,437天收集的M. abscessus菌株。(D) 对两种从BPD33HTH_HRM10和D29_HRMGD40感染中恢复的存活者进行噬菌体敏感性测试，这些存活者来自噬菌体治疗开始前1,437天收集的M. abscessus菌株，显示两者都对噬菌体完全敏感。噬菌体测试方法如(A)所述。

对结核菌噬菌体给药的临床反应

在2020年9月，当这位病人因为肺部病情加重而住院时，我们开始了噬菌体治疗。当时他的状况接近基线水平。从2020年9月到2022年3月，我们每天通过静脉注射两次，给他大约10^9个噬菌体单位的BPsΔ33HTH_HRM10和10^8个单位的D29_HRMGD40。治疗过程中他耐受得很好，没有出现任何不良反应。开始噬菌体治疗后的第5天，他就出院了。在接下来的一年里，他因为典型的肺部病情加重症状四次住院，其中一次还因为植入的静脉通道感染了MRSA而引发了败血症。从噬菌体治疗开始的第5天到第362天，我们共收集了17次痰液样本进行非结核分枝杆菌（NTM）培养。在前96天内，M. abscessus的培养结果大部分是阳性的（7次中有6次）。但是，在最近的10次培养中（第116天到第362天），有9次是阴性的，只在第245天发现了一次阳性菌株（见图1A）。相比之下，在同一时间段内，只有13次气道培养中的1次（7.7%）对P. aeruginosa或MRSA是阴性的（见图1F）。从抗生素治疗开始（噬菌体治疗前第-1236天）到噬菌体治疗开始，痰液培养中有77.9%（68次中的53次）是M. abscessus阳性，而在噬菌体治疗开始后的一年内，这一比例下降到了41.1%（17次中的7次）（通过双尾Fisher精确检验，p = 0.006），在最近的280天的噬菌体和抗生素治疗中，只有10%（10次中的1次）是阳性，与仅使用抗生素治疗时相比有显著差异（p = 0.0001）。在噬菌体治疗开始后的第89天，病人还开始使用CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节蛋白）调节剂elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（E/T/I），这是在FDA批准该药物用于H199Y CFTR基因突变后（NIH和美国国家医学图书馆，2021年）。在噬菌体治疗开始后的一年内，他的1秒用力呼气量（FEV1）在23%到31%（预计值）之间，与噬菌体治疗前没有差异。然而，他不住院的时间增加了（见图1C）。基于M. abscessus感染得到控制的证据，他在噬菌体治疗开始一年后被列入肺移植名单，并在第379天成功接受了移植。

系统分析外植肺组织和移植后病程

在进行肺移植时，对受者的肺部进行了检查，寻找脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的证据。对支气管肺泡灌洗液（BAL）、未经处理的支气管分泌物拭子、每个肺叶的大体病理和均质化组织以及主支气管血管边缘进行了酸染杆菌（AFB）的染色，并进行了非结核分枝杆菌（NTM）和细菌的培养，并通过实时定量PCR（qPCR）进行了分析（Rocchetti等人，2017年；图1G）。所有样本类型在所有肺叶中均未通过染色检测到AFB。培养结果显示所有肺叶和左侧主支气管（LMB）均有铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），并且两个肺叶中生长了鸟分枝杆菌（M. avium）。通过qPCR检测，在三个肺叶的BAL和一叶的支气管分泌物中检测到M. abscessus DNA，但没有一个匹配样本中培养出M. abscessus（图1G）。移植肺的大体病理未显示肉芽肿，且在任何切片中均未观察到AFB（补充图S1）。在噬菌体治疗的第500天（移植后121天）通过BAL采集的额外五个气道培养样本对M. abscessus均为阴性，没有临床证据表明感染扩散。受者经历了无并发症的移植后恢复，肺功能正常化（图1B），并且继续接受噬菌体和抗生素治疗。  

图S1 移植肺的大体和显微镜病理检查，与图1G相关。左肺和右肺显示出相似的变化，因此一起描述。(A和B) (A) 肺的侧面，和 (B) 肺的内侧。胸膜表面呈棕紫色，有皱纹，暗淡，显示出中等程度的鹅卵石样改变和硬化。没有明显可见的肿块或病变。主支气管从边缘突出，显示出适量的棕褐色粘液内容物。左肺和右肺的H&E染色切片显示广泛的支气管扩张，支气管和细支气管扩张常与急性支气管肺炎相关，由中性粒细胞、粘液和细胞碎片组成，位于气道腔内。细支气管显示出严重的慢性细胞性细支气管炎，小淋巴细胞环绕细支气管。存在与支气管相关的淋巴组织聚集；然而，未识别出淋巴滤泡。支气管和细支气管都显示出瘢痕，气道周围有密集的同心圆纤维化，并局部延伸到相邻的肺泡肺实质。此外，还有小区域的片状轻度至中度间质瘢痕，可能是由先前解决的感染过程引起的。未识别出肉芽肿或多核巨细胞。气腔中没有组织性肺炎。抗酸杆菌和GMS的组织化学染色对分枝杆菌和真菌形态均为阴性。(C) 整个切片图像显示气道扩张，伴有细支气管炎和细支气管炎周围瘢痕（H&E染色切片，比例尺，5毫米）。(D) 扩张的细支气管，慢性细支气管炎，细支气管炎周围瘢痕，腔内有中性粒细胞（H&E染色切片，5倍物镜放大，比例尺，500微米）。(E) 细支气管有纤毛柱状上皮和腔内中性粒细胞和碎片，与急性支气管肺炎一致（H&E染色切片，10倍物镜放大，比例尺，200微米）。(F) 严重的慢性细胞性细支气管炎，细支气管壁内有同心圆的淋巴细胞炎症（H&E染色切片，4倍物镜放大，比例尺，600微米）。(G) 轻度间质瘢痕区域，可能是由远处/已解决的感染过程引起的（H&E染色切片，5倍物镜放大，比例尺，500微米）。(H) 中度间质瘢痕区域，可能是由远处/已解决的感染过程引起的（H&E染色切片，4倍物镜放大，比例尺，600微米）。(I) 慢性细胞性细支气管炎，淋巴细胞环绕并浸润扩张的细支气管的纤毛柱状上皮（H&E染色切片，10倍物镜放大，比例尺，300微米）。

噬菌体治疗期间的放射学变化

连续的高分辨率计算机断层扫描（CT）显示了严重的弥漫性静脉曲张上叶囊性支气管扩张，伴随左肺尖有空洞。存在多发性黏液阻塞、广泛的马赛克衰减，以及散在的边界不清晰的结节。特别是在右下叶（RLL），局灶性树芽征象最为明显。将治疗前扫描与噬菌体治疗后第81天和第229天的扫描中与非结核分枝杆菌（NTM）感染相关的选定放射学特征进行了比较（图3）。在第81天，观察到与噬菌体治疗相关的实质性结节尺寸减小的明显例子；然而，这种改善并不均匀，同时也存在恶化的巩固和黏液堵塞区域。到了噬菌体治疗后第229天，可以看到额外的改善区域。  

图3 噬菌体治疗期间的放射学变化。(A) 左边：治疗前的轴位CT显示左肺尖有一个空洞。中间：治疗第81天时，几乎没有变化。右边：治疗第229天时，空洞几乎完全消失了。(B) 左边：治疗前的轴位CT显示广泛的支气管扩张和粘液堵塞，以及舌叶部位的一个实变团块（红色箭头）。中间：治疗第81天时，支气管扩张和粘液堵塞基本没有变化，但舌叶的团块显著减小（蓝色箭头）。右边：治疗第229天时，实变消失了（绿色箭头），左中肺区域的粘液堵塞也大幅改善。(C) 左边：治疗前的轴位CT显示广泛的支气管扩张和粘液堵塞，以及左下叶的一个实变团块（红色箭头）。中间：治疗第81天时，支气管扩张和粘液堵塞有所改善，左下叶的团块也显著减小（蓝色箭头）。右边：治疗第229天时，实变消失了（绿色箭头），支气管扩张的气道总体上减小了。(D) 左边：治疗前的轴位CT显示左上叶广泛的支气管扩张和粘液（红色箭头）。中间：治疗第81天时，支气管扩张和粘液堵塞基本没有变化，但在左上叶前部出现了一个新的实变结节（蓝色箭头）。右边：治疗第229天时，第80天出现的实变结节消失了（绿色箭头）。  

不依赖培养的标志物显示脓肿分枝杆菌溶解的证据

对17个痰样本中的M. abscessus DNA进行了分子定量分析，这些样本的时间跨度从噬菌体治疗前136天到治疗后361天，并通过实时定量PCR（qPCR）与传统培养方法进行了对比分析（图4A）。与已知浓度的M. abscessus的标准曲线相比，第136天至第82天的痰样本显示，在该时间段内，M. abscessus DNA的一致性检测与阳性培养结果相对应（见图4B和S2）。第136天至第3天的痰样本中M. abscessus DNA浓度接近检测限（LOD），在培养转阴前的第47天和第82天观察到M. abscessus DNA的增加。在第130天至第361天收集的9个痰样本中未检测到M. abscessus DNA（低于LOD），与该时间段内主要阴性培养结果一致。参与者在肺移植后无法产生痰液。

非结核分枝杆菌（NTM）细胞壁脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）是所有分枝杆菌种类中发现的一种糖脂，当通过气相色谱/质谱（GC/MS）在囊性纤维化（pwCF）患者的尿液中分析时，它是一种敏感的NTM气道感染标记物。在从噬菌体治疗前1,132天到治疗后500天的样本中测量了尿液LAM成分D-阿拉伯糖（D-Ara）和结核杆菌酸（TBSA）（见图4C、S2和S3）。噬菌体给药后尿液中LAM成分的检测增加，并在第47天达到峰值，这与单独抗生素治疗时相比，M. abscessus细胞壁溶解的增加一致。到第82天，尿液LAM水平低于噬菌体治疗前的水平，到第152天大体上无法检测到，这与总体NTM负担的减少一致，如痰液培养结果所示（见图4A）。  

NTM感染状态可以通过测量血浆中针对鸟分枝杆菌复合体（M. avium complex）和脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的抗体来分析，这使用的是所有分枝杆菌共有的抗原。抗分枝杆菌免疫球蛋白与LAM和分枝杆菌细胞壁的其他成分紧密结合，并且在NTM治疗中观察到IgA的下降。在从噬菌体治疗前第1795天到治疗后第500天的样本中测量了血清中针对M. abscessus的IgA和IgG抗体（见图4D）。与治疗前相比，噬菌体治疗期间平均IgA滴度下降，平均IgG滴度也呈下降趋势，这与感染负担的减少一致。与噬菌体治疗前一年相比，在肺移植后，IgG和IgA的滴度进一步显著下降。

血清和痰液样本通过常规PCR检测了噬菌体DNA的存在，所有样本均为阴性。血清中未检测到信号与先前关于噬菌体在血液中快速清除的报告一致。尽管在12个月内测试了18个痰液样本，但有可能噬菌体颗粒存在于一个狭窄的时间框架内，而这一时间框架没有被痰液采样捕获，或者噬菌体DNA的存在低于检测限。在移植肺的样本中，通过PCR也未检测到噬菌体DNA。

图4 不依赖培养的方法显示了M. abscessus溶解和宿主反应的证据。(A) 气道培养结果与噬菌体治疗开始前后的天数对比。在噬菌体治疗开始之前，痰液培养结果主要是阳性（红线）。噬菌体治疗后，直到第96天，7次培养中有6次是阳性的。从第116天起，培养结果主要变为阴性（黑线），直到第362天，有10次中的9次是阴性的。在这个时间段内，第245天只恢复了一个持续的菌株。移植后，通过BAL（支气管肺泡灌洗）额外进行了5次培养，直到噬菌体治疗的第500天都是阴性的。(B) 痰液中M. abscessus DNA的qPCR分析。y轴显示了根据标准曲线推算出的M. abscessus DNA浓度（pg/μL）。(C) 尿液LAM（肺泡蛋白）。LAM的组成部分D-Ara（灰色方块）和TBSA（棕色菱形）与天数对比。两种成分的水平在噬菌体治疗开始后的第47天达到峰值，到了第152天都低于检测限，并且在移植后继续下降。(D) 血清中针对M. abscessus的免疫球蛋白与天数对比。测量的免疫球蛋白有IgA（黑色方块）和IgG（灰色圆圈）。通过简单的线性回归模型，使用噬菌体治疗前、噬菌体治疗期间和移植后的时间段作为唯一的协变量，来测试每个治疗阶段免疫球蛋白的下降情况。使用回归系数或线性组合的t检验，来比较每个时期的平均水平。与噬菌体治疗前的滴度相比，在移植前的噬菌体治疗过程中，IgA显著下降（p = 0.05），而IgG的平均值也呈下降趋势（p = 0.17）。与噬菌体治疗的前一年相比，移植后IgG和IgA都进一步下降（两者的p值均小于0.001）。另见图S2、S3和S4。

噬菌体治疗后脓肿分枝杆菌亚种abscessus分离株的遗传多样性降低

在噬菌体治疗后，共收集了36个不同时间点的40个分离株，从噬菌体治疗前第1555天到治疗后第245天，对它们进行了全基因组测序，以分析遗传变化和对噬菌体治疗的反应（见图5A）。在抗生素治疗之前回收的M. abscessus分离株揭示了从全球CF和非CF人群中主要流行的M. abscessus亚种abscessus克隆1的共同祖先演化而来的多个亚系。基于分化定年分析的初始感染时间估计为2013年11月（噬菌体治疗前第2494天；95%最高后验密度（HPD）区间：噬菌体治疗前第3435天，噬菌体治疗前第1945天），大约比首次培养检测提前了30个月（见图1E、5A和S5）。随着针对M. abscessus的抗生素治疗的开始（噬菌体治疗前第1236天），随着新的A、B和C亚系的出现，种群发生了明显的变化（见图5A）。在编码潜在毒力因子的基因中出现了显著的突变，如MntH和转录调节因子FeoA和RnE。随着噬菌体治疗的开始，M. abscessus种群的遗传多样性减少，只有C亚系的分离株在痰液培养转阴前被回收，而一个在噬菌体治疗后第245天从B亚系回收的分离株例外，该分离株自噬菌体治疗前第60天以来未曾被观察到（见图5A）。总的来说，分离株群体在核心基因组中表现出的平均替换率为每年每个位点2.7 × 10^-7次突变（见图S5），与先前对M. abscessus亚种abscessus的估计相似。任意两个分离株之间的最大遗传距离仅为核心基因组中的11个单核苷酸多态性（SNPs）。通过连续M. abscessus分离株的基因含量比较，也评估了随时间的基因组变异（见图5B和S6）。对于每对连续的分离株，执行了泛基因组分析，以识别仅存在于一对样本中的基因（即，辅助基因；见图5B，y轴）。所有连续分离株对的辅助基因范围为0%至1.4%，没有质粒获取或病毒DNA并入细菌基因组的证据。大约在抗生素治疗开始后1年观察到辅助基因含量的减少，噬菌体治疗后回收的分离株对与噬菌体治疗前回收的分离株对相比，遗传多样性显著降低（p = 0.0055，Wilcoxon两样本检验）。随着时间的推移，辅助基因的减少表明由于抗生素和噬菌体治疗的结果，遗传多样性降低，并选择了一个同质的种群。

图5 M. abscessus的遗传多样性和抗生素敏感性。(A) 在感染和治疗过程中，M. abscessus菌株（n = 40）的遗传谱系图。基于全基因组单核苷酸多态性（SNP）数据，使用BEAST v1.10.4创建了时间尺度的系统发育树。x轴代表自噬菌体治疗开始以来的天数。菌株在分支尖端用彩色编码的符号表示，最近共同祖先（MRCAs）在节点上标记为开放圆圈。红色数字表示每个进化分支上发生的非同义突变数量。选定突变的蛋白质注释标记在分支上。(B) 对连续的M. abscessus菌株进行基因含量比较，以评估随时间的基因组变异。对于每对连续的菌株（x轴），进行泛基因组分析，以识别仅存在于一个样本中的独特附属基因。y轴（%附属基因）定义为附属基因的总数/这对菌株中所有基因的总和。噬菌体治疗后的菌株对的多样性显著低于治疗前的菌株（通过Wilcoxon两样本检验，p = 0.0055）。黑色三角形代表在开始M. abscessus抗生素治疗前的菌株对，蓝色正方形代表抗生素开始后的菌株对，红色圆圈代表噬菌体治疗开始后的菌株对。随着时间的推移，附属基因的减少表明遗传多样性的减少，并选择了一个均质的种群。(C) M. abscessus菌株在噬菌体治疗后抗生素抗性并未增加。将抗药性类别的数量与噬菌体治疗前后的天数对比绘制。黑色三角形代表在开始M. abscessus抗生素治疗前的菌株，蓝色正方形代表抗生素开始后的菌株，红色圆圈代表噬菌体治疗开始后的菌株。简单线性回归显示，在噬菌体治疗前，抗药性类别数量随时间的增加斜率显著增加（蓝线±95% CI，p = 0.0007）。噬菌体治疗开始后，斜率显著为负（红线±95% CI，p = 0.009）。另见图S5和S6。

Accessory genes（附属基因）是指那些不是所有菌株都必需的基因，它们不参与基本的生物学过程，如生长和生存，但在某些特定环境或条件下可能对菌株有益。这些基因通常不是必需的，但可以提供某种形式的优势，例如抗生素抗性、毒素产生或对环境压力的适应性。在泛基因组分析中，研究人员会对比不同菌株的基因组，以确定哪些基因是共有的，哪些是某些特定菌株独有的。附属基因就是那些在某些菌株中存在而在其他菌株中不存在的基因。这些基因可能与菌株的特定功能或适应性有关，例如在某些环境中生存的能力，或者与宿主相互作用的能力。

菌体治疗后，脓肿分枝杆菌亚种脓肿分离株的抗生素耐药性没有增加

在感染过程中回收的所有M. abscessus分离株（n = 71）都经过了20种抗生素的测试，这些抗生素用于治疗NTM感染（见表S1）。大多数测试的抗生素在感染和治疗过程中持续表现出耐药性或活性变化很小。具有可用的临床和实验室标准研究所（CLSI）解释指南的代表性抗生素类别包括阿米卡星、克拉霉素、头孢西丁、多西环素、亚胺培南、利奈唑胺、莫西沙星和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（TMP/SMX）。这些抗生素的耐药类别数量在感染过程中的分离株中有所增加，不同分离株之间的变异性相当大（见图5C）。在噬菌体加入抗生素治疗后，噬菌体治疗后分离株的耐药性没有进一步增加，这表明噬菌体和抗生素的结合使用并未导致更大的抗生素耐药性。

噬菌体疗法未选择噬菌体耐药分离株

噬菌体抗性的出现是一个可能的限制因素，可能会降低任何噬菌体治疗的有效性。从噬菌体治疗后的第5天、第44天和第245天以及治疗前的第323天和第60天回收的痰液中分离出的M. abscessus分离株，都经过了噬菌体敏感性测试（见图2A）。所有分离株都对BPsD33HTH_HRM10和D29_HRMGD40两种噬菌体敏感，并且与初始菌株具有相同的噬菌体感染特征（见图2D）。因此，即使在治疗开始后超过8个月回收的分离株中，也没有观察到噬菌体抗性的出现。  

噬菌体处理前后噬菌体的抗体识别

噬菌体治疗也可能因宿主对静脉注射噬菌体治疗迅速产生的抗噬菌体中和抗体而失败（Dedrick等人，2021b）。在噬菌体治疗前第1天和治疗后第44天、第149天和第269天收集的血清被检测了对两种使用中的噬菌体的IgG结合（见图6A）。令人惊讶的是，这个体在噬菌体治疗之前就对两种噬菌体都有大量的IgG反应，而在治疗后的血清中，这种反应适度增加，如半最大滴度（见图6A）所示。在治疗后的第3天至第500天测试的血清显示，BPsD33HTH_HRM10感染的血清介导的中和作用逐渐增加，在治疗后第242天及以后明显失活（见图6B）。然而，只观察到对D29_HRMGD40的轻微中和（见图6B）。这些观察表明，该个体之前自然接触到了诱导对这里使用的两种噬菌体免疫交叉反应的噬菌体，但这种交叉反应与BPs或D29的关系不够密切，未能启动中和活性。此外，直到治疗相对较晚的时候，才对BPsD33HTH_HRM10产生了大量额外的抗体反应，此时痰液培养已大部分转为阴性。这些抗体似乎不会交叉反应以中和D29_HRMGD40，后者可能在整个治疗过程中保持活跃。

图6 噬菌体治疗前后的抗体结合情况表明，抗噬菌体中和抗体的产生较晚。(A) 在噬菌体治疗前第-1天收集的预噬菌体血清以及噬菌体治疗开始后指定时间点的IgG抗体的半最大滴度，针对噬菌体BPsΔ33HTH_HRM10和D29_HRMGD40。二至六次重复实验的滴度以白色数据点显示在平均值条上方，并附有标准差（SD）。(B) 在噬菌体治疗开始前1天收集的血清以及治疗后指定时间点的血清被用来测试噬菌体BPsΔ33HTH_HRM10、D29_HRMGD40以及对照噬菌体Fionnbharth Δ45-47的中和能力。数据代表了重复或三重复实验的结果。

讨论  

在可能对多类抗生素具有耐药性的严重感染情况下，人们越来越倾向于使用噬菌体进行治疗。慢性肺部感染M. abscessus是一个特别具有吸引力的治疗目标，因为当前的指南推荐在初始培养转阴后至少进行12个月的三种或更多药物的组合治疗。当以根除感染为衡量标准时，这种抗生素治疗通常并不成功，这可能是因为M. abscessus能够形成生物膜或在宿主细胞内存活，加上在粘液栓或空洞中的身体隔离，这些因素共同可能有效地保护病原体免受抗生素治疗浓度的影响。在CF肺部疾病的背景下，治疗更具挑战性，因为与其他细菌病原体的共感染降低了气道培养监测治疗反应的灵敏度。鉴于M. abscessus在免疫抑制后能够扩散到皮肤、软组织和骨骼，未受控制的感染被认为是移植的禁忌症。

目前，还没有关于成功使用噬菌体治疗M. abscessus肺部感染的报告。2019年，有报道称一名15岁CF女孩在肺移植后发展为播散性M. abscessus亚种massiliense感染，使用分枝杆菌噬菌体治疗后受益。在这一病例中，噬菌体混合物由三种分枝杆菌噬菌体组成，包括BPsD33HTH_HRM10，它也用于当前病例，是一种经过基因改造的温和噬菌体衍生物，能更有效地杀死其宿主。噬菌体方案导致皮肤结节尺寸减小，胸骨伤口感染改善，通过PET-CT（正电子发射断层扫描-计算机断层摄影）扫描评估的腹部淋巴结减小，以及总体临床状况改善。没有观察到对噬菌体的耐药性，也没有发生中和免疫反应，这可能是由于使用了免疫抑制药物来支持新移植的肺。在最近的一份报告中，关于非CF支气管扩张症背景下由M. abscessus亚种massiliense引起的肺部感染的治疗，由于强大的IgM和IgG介导的中和抗体反应，噬菌体治疗失败。在一些情况下，预期的患者在接受治疗前就已经去世。  

在当前病例中，有强有力的证据表明，在给予分枝杆菌噬菌体后，M. abscessus发生了生物学上显著的溶解。目前，判断M. abscessus肺部疾病治疗效果的“金标准”是痰液培养结果从阳性转为阴性。然而，在CF的背景下，NTM痰液培养的灵敏度特别低，因为需要对P. aeruginosa和其他共生病原体进行细菌去污染，这显著降低了M. abscessus的活性。在这位患者身上，从第一次M. abscessus阳性到开始噬菌体治疗期间，单独痰液培养的灵敏度仅为70.3%（91次中有64次阳性）。然而，在噬菌体治疗前4.2年的感染期间，从未有过连续两次以上阴性培养（见图1）。鉴于他肺部疾病的严重空洞性质，无法知道是否通过气道样本测试完全根除了M. abscessus。然而，与抗生素结合使用，感染的负担降低到了痰液培养和所采用的非培养检测方法的检测限以下。囊性纤维化基金会和欧洲囊性纤维化协会推荐，接受NTM治疗并且连续培养结果为阴性的CF患者可能有资格进行移植登记。因此，在明显对治疗有反应后，该参与者在之前被拒绝后被提供了肺移植。对移植肺组织的分析支持了这样的结论：肺部的活性M. abscessus已被灭菌，即使在物种特异性qPCR检测到相同样本中的M. abscessus DNA的样本中，AFB染色和培养也是阴性的。持续的阴性气道培养在移植后的第一个月加强了这一主张。  

在治疗期间，没有任何证据表明M. abscessus对噬菌体产生了遗传抗性。对40个M. abscessus分离株进行了近5年的纵向遗传分析，这与之前的M. abscessus研究一致，表明主要是克隆感染，随着时间的推移出现了适应的亚系。尽管在分离株的核心基因组中遗传变化有限，但在多个亚系中观察到相同基因的非同义突变。例如，在抗生素治疗过程中，编码FeoA转录阻遏蛋白的基因在亚系A和C的最近共同祖先（MRCA）以及亚系B的一个分支中获得了独立突变（见图5A）。在CF气道中慢性M. abscessus感染期间，已观察到转录调节因子在宿主内的平行进化的类似例子，这可能反映了对肺部环境的适应。泛基因组分析揭示了抗生素和噬菌体治疗后辅助基因的大幅减少，这与选择持久和同质种群一致（见图5B和S6）。在噬菌体治疗开始后，只观察到来自亚系C的分离株，这表明噬菌体混合物在杀死A和B亚系的亚群方面可能比C更有效（见图5A）。然而，在近5个月的阴性培养后，回收了一个亚系B的分离株，但它没有显示出增加的抗生素或噬菌体抗性，这表明它可能通过在肺腔或气道生物膜中的隔离而逃避了噬菌体治疗。

在对P. aeruginosa和Acinetobacter baumanii进行噬菌体治疗的案例中，已有报道称出现了噬菌体抗性的发展，以及出现了与原始感染菌株具有不同抗生素敏感性谱的新细菌分离株。有人建议，同时使用一种以上的噬菌体以及与抗生素结合治疗是防止这种情况发生的有用策略。噬菌体治疗和传统抗生素使用之间的关系是复杂的，并且尚未完全理解。在不同条件下，噬菌体和抗生素联合使用的体外研究已经确定了附加的、协同的、拮抗的或没有效果。噬菌体可能通过改变细胞壁的渗透性和抗生物膜机制而增加对抗生素的敏感性。在当前病例中，回收的最终分离株没有表现出增加的抗生素抗性，这支持了噬菌体治疗没有促进抗生素抗性的结论，而且在第245天回收的持续存在分离株可能起源于一个腔室或闭塞的气道，那里的抗生素和噬菌体治疗未能穿透。  

鉴于与M. abscessus治疗相关的抗生素和噬菌体治疗的持续时间非常长，抗噬菌体中和抗体的出现是一个潜在的关注点。在以前的报告中，抗体发展的缺乏与一例移植后免疫抑制情况下的成功治疗相关，而抗体的快速发展与另一例治疗失败相关。在当前病例中，在对其中一种噬菌体产生显著中和抗体之前，痰液培养已转为阴性。基于体外实验，即使到第149天BPsD33HTH_HRM10被中和显著削弱（见图6），D29_HRMGD40仍然活跃。因此，尽管选择了两种噬菌体混合物以最小化任何潜在的噬菌体抗性，但也存在这样的可能性：即使观察到对一种噬菌体的中和，另一种噬菌体可能免疫原性较低。我们注意到，到了第+245天，当D29_HRMGD40实际上是唯一活跃的噬菌体时，没有观察到对该噬菌体的抗性（见图2），这与M. abscessus中噬菌体抗性不频繁的其他报告一致，这对于分枝杆菌噬菌体的治疗使用可能是一个潜在的显著优势。

我们的研究结果，基于客观的科学指标，为在晚期囊性纤维化（CF）肺部疾病中成功进行噬菌体治疗提供了一张路线图。了解治疗开始后初始反应、放射学改善和培养结果转变所需的时间跨度，对于未来的治疗应用和临床试验设计至关重要。同样重要的是使用补充的、不依赖培养的M. abscessus溶解标志物，这些标志物可以克服痰液培养的低敏感性，以及在密集实变或实质空腔区域无法测量疾病的能力。M. abscessus在气道中的生物学特性可能有助于避免在治疗CF气道中其他常见病原体时遇到的一些陷阱。特别是，大多数M. abscessus感染的特点是与单一共同祖先密切相关的谱系，具有相对较高的遗传稳定性（Davidson等人，2021b）。这可能限制了在P. aeruginosa噬菌体治疗中出现的噬菌体耐药菌株的出现，因为在感染过程中，由于选择超突变基因型和新的环境克隆的再感染，经常存在广泛的遗传多样性和可塑性（Rossi等人，2021）。可能需要在感染早期使用噬菌体和抗生素来改善肺功能，但这样做的风险是可能会产生抗噬菌体的中和抗体，从而限制了后期治疗的选择。然而，根据这份报告，可以考虑在非常晚期的肺部疾病中使用噬菌体，目标是充分控制M. abscessus，作为肺移植的桥梁。

研究的局限性在评估这位患者噬菌体治疗的效果时，我们遇到了这类复杂病例的典型问题。由于我们没有听说过以前有成功使用噬菌体治疗肺部M. abscessus感染的案例，我们无法知道这个单一案例的发现是否代表了其他可能接受这种治疗的人。此外，可能还有未被识别的因素以各种方式影响了治疗反应。噬菌体是除了基于指南的CF肺部疾病治疗（Mogayzel等人，2013年；Ren等人，2018年）以及针对M. abscessus、耐多药P. aeruginosa和MRSA的强化抗生素治疗之外给予的。在噬菌体治疗之前，抗生素治疗的选择是多样的，但与噬菌体一起使用的药物组合相对恒定。在噬菌体治疗的第89天，作为标签内治疗，引入了CFTR调节剂E/T/I，这是因为FDA批准了其用于H199Y CFTR基因突变的标签扩展（NIH和美国国家医学图书馆，2021年）。这个标签扩展并不是基于临床试验的结果，而是基于体外研究，这些研究证实在表达H199Y CFTR基因突变的FRT细胞中，氯离子运输至少比基线增加了10%（NIH和美国国家医学图书馆，2021年）。之前没有关于E/T/I在H199Y/2184insA CFTR基因型的CF患者中的使用报告，其临床益处的程度也不得而知。E/T/I可能在改善气道清除和营养方面提高了宿主反应的能力；然而，这位患者在使用E/T/I后并没有显示出肺功能的改善或痰液产量的减少，而且在移植时他的气道炎症程度很严重。E/T/I对M. abscessus没有已知的直接抗生素特性，而且不依赖培养的NTM溶解标志物显示在E/T/I开始之前就有反应。在一些CF患者中，使用第一种CFTR调节剂伊伐卡夫托（ivacaftor）进行高效调节剂治疗（HEMT）与P. aeruginosa的相对丰度减少和明显根除有关（Hisert等人，2017年；Yi等人，2021年）。然而，这位患者仍然感染了P. aeruginosa和MRSA，而且在移植的肺组织中发现了M. avium，这支持了M. abscessus的根除是噬菌体治疗的特定反应，而不是E/T/I之后总体改善的结果。尽管如此，E/T/I通过部分恢复CFTR功能可能导致气道微环境的有益变化，这可能有助于对噬菌体治疗产生更成功的反应。