【Analytica Chimica Acta】华中农业大学开发了一种基于噬菌体和金纳米颗粒的可视化沙门氏菌检测方法

沙门氏菌是一种危险的食源性病原体，可引致严重的食源性疾病，并可能危及生命。沙门氏菌的快速、灵敏检测对控制其在食品中的传播起着关键作用。目前，传统的培养方法是检测沙门氏菌的主要手段，不过这是一个耗时且繁琐的过程，不能满足快速检测的要求。免疫分析、分子生物学和生物传感器等技术目前也被广泛应用于微生物检测，但这些技术要么灵敏度和稳定性需要提高，要么需要高水平的专业知识和受控环境，要么不能明确区分活细胞和死细胞，导致假阳性，要么检测成本很高。考虑到区分活细菌和死细菌的挑战，以及现有沙门氏菌快速检测技术的耗时性，迫切需要一种准确、方便和直接的现场筛分方法，在沙门氏菌检测中区分活细菌和死细菌。

2023年9月1日，华中农业大学在著名期刊Analytica Chimica Acta发表了题为A visual colorimetric assay based on phage T156 and gold nanoparticles for the sensitive detection of Salmonella in lettuce的研究论文，该研究开发了一种基于噬菌体T156和金纳米颗粒的可视化比色法，可用于快速且特异性地检测生菜中沙门氏菌。

研究结果

本文建立了一种基于噬菌体T156和AuNPs特异性结合的快速灵敏的沙门氏菌检测方法(图1) ，并将其应用于莴苣样品。首先噬菌体被静电吸附在纳米粒子表面，保护它们在高浓度盐溶液中不受聚集损害。当目标宿主细菌(沙门氏菌)被添加时，噬菌体将特别识别和吸附到细菌表面，导致AuNPs聚集远离噬菌体。这个过程可以用肉眼观察到，因为这些金纳米粒子的酒红色变成了紫色和蓝色。此外，作者也测量了溶液的紫外线吸收光谱，以便快速检测沙门氏菌。

图1 沙门氏菌的快速检测过程

T156噬菌体的宿主范围是在作者之前在实验室中确定的，该噬菌体可以裂解36株不同的沙门氏菌血清型(如鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13076) ，包括21株耐药沙门氏菌。此外，噬菌体T156还能裂解大肠杆菌T10和李斯特菌ATCC 19115，表明其具有广谱裂解活性。这意味着T156噬菌体可以有效地应用于沙门氏菌检测方法的研究。

总的来说，这是具体的检测过程是将制备的纳米粒子的pH值调整为6.5，然后加入噬菌体T156(6.67×108PFU/mL)并混合50分钟。然后加入一系列浓度的待检测鼠伤寒沙门氏菌(3.8 × 101-3.8 × 109CFU/mL) ，并置于37 °C和160r/min的定温振荡器中30分钟。然后加入10μL的81.3 m氯化钠观察颜色的变化，并记录在520nm和680nm处的吸光度值以及A680/A520比值。利用噬菌体和AuNPs可视化技术检测不同浓度的沙门氏菌或基质样品溶液，以细菌溶液的浓度作为水平坐标，以A680/A520比值作为垂直坐标，建立标准曲线。

作者通过紫外扫描、粒度分布、透射电子显微镜（TEM）和zeta电位分析对制备的AuNPs进行了表征，结果如图2所示。图2(A)显示在紫外光照射下，金纳米粒子呈现紫红色，并在520nm处呈现窄而对称的最高吸收峰，显示产生了高质量的金纳米粒子。根据图2(C)，作者利用纳米粒子大小的恒电位器，测量了纳米粒子的电位大小为-37.03mV，表明纳米粒子表面带有负电荷。如图2(B)、(D)和(E)所示，这些纳米粒子呈现均匀的球形和大小，显示出平均直径约为15nm的优异分散。

图2 AuNPs的表征概况

接着作者对比色检测系统的关键参数进行了优化，并进行了验证。如图3(A)所示，当pH值设定为4.5时，金纳米粒子聚集在一起，紫外可见吸收光谱显示出红移。图3(B)显示吸光度A680/A520比率的下降趋势，当pH值在4.5至8.5之间变化时，随后呈上升趋势。当吸收pH值为6.5时，峰值最高，峰值宽度最窄。此外，在pH=6.5时，吸光度的A680/A520比率最低。在加入盐离子后，大部分金纳米粒子与噬菌体的结合没有任何沉淀，表明6.5的pH值在噬菌体和金纳米粒子之间提供了最有利的结合程度。随后，确定了最佳的噬菌体加入量。图3(C，D)显示结果，表明噬菌体加入量为12μL时达到最低的A680/A520比率，对应于最终的噬菌体浓度为6.67×108PFU/mL。在这种剂量下，金纳米粒子表现出最高的稳定性。当噬菌体静电吸附到AuNPs上时，电位大小被测量为-25.09mV。这种潜在尺寸的减小表明，由于金纳米粒子与噬菌体的结合，它们周围的负电荷减少了。如图3(E和F)所示，可以观察到随着时间的增加，A680/A520比率在50分钟后保持不变。这表明大部分噬菌体此时都被吸附在纳米粒子的表面，从而阻止了纳米粒子上盐离子的聚集和沉淀。因此，50分钟是最佳的吸附时间。图3(G)表明，当NaCl浓度为2.6M时，AuNPs从紫红色变为深红色；然而，当NaCl浓度达到2.7M时，AuNPs变为紫色。吸收峰向红色端移动，520nm处的吸收强度逐渐减少，这表明部分金纳米粒子积聚。这表明NaCl度超过了噬菌体保护的金纳米粒子的盐离子浓度阈值。根据图3(I和J)所示的结果，可以观察到随着噬菌体与宿主细菌之间的孵化时间增加，吸光度的A680/A520比率也增加。这表明大量的噬菌体被特异性地吸附在宿主细菌的表面上，导致这些噬菌体从AuNPs的表面脱落。结果表明由于盐离子的存在，大量的金纳米粒子积累，导致在30分钟后达到最大的吸光度。作者采用双层平板法测定与AuNPs结合的噬菌体数量。图3(L)显示离心后沉积物中的噬菌体数量(即吸附的噬菌体数量)为3.94×108PFU/mL，成功吸附速度为73.48%。作者采用稀释涂层法测定金纳米粒子内宿主细菌(沙门氏菌ATCC 13311)在不同时间的活性变化。以PBS溶液作为空白对照组。图3(K)显示宿主细菌的活性在5~50分钟内没有明显变化。因此，金纳米粒子对宿主细菌活性的影响是可以接受的，不会干扰测试结果。

图3 视觉检测反应的优化

随着细菌溶液浓度的增加，紫外吸收光谱向红色端移动，520nm处的吸光度逐渐减小，而680nm处的吸收率逐渐增加，出现了吸收峰。在视觉上，金纳米粒子的颜色从勃艮第红变成紫红色，最终变成深紫色。在x轴上绘制细菌溶液浓度，在y轴上绘制吸光度A680/A520比率，以生成标准曲线。两者在3.8×101-3.8×109CFU/mL范围内呈线性关系，标准方程y=0.08821x+0.1111，R2=0.9529。

图4 AuNPs的颜色变化和紫外可见吸收光谱以及其标准曲线

对于特异性实验(如图5所示)，作者用AuNP探针针对三种不同的鼠伤寒沙门氏菌菌株(即ATCC 13311、ATCC 14028和ATCC 13076)进行测试。如图5(A)所示，AuNP探针显示出不同程度的聚集(蓝线、绿线和棕色)，紫外吸收最高，比率为0.6至0.8之间的A680/A520。另一方面，其他菌株和空白对照组则没有发现金黄色聚集，而且有明显的颜色变化，最高紫外吸收峰在1.2和1.4之间，吸光度A680/A520比值在0.2之间。这些结果显示沙门氏菌与其他菌株的特异性较高，因此表明这种方法适合快速检测沙门氏菌。

图5 特异性分析

结论

本研究利用噬菌体 T156和金纳米粒子，建立了一种灵敏地检测食品中沙门氏菌的可视化比色分析方法。作者使用噬菌体作为生物识别元件，而不是抗体或适体，该方法确保了优异的特异性和准确性，同时具有成本较低、更容易获得和能够区分活细菌和死细菌等优点，从而减少了假阳性结果的发生。金纳米粒子的光学特性使得可视化检测样品中的沙门氏菌成为一种更加方便和快速的方法。该方法检测范围为3.8 × 101-3.8 × 109 CFU/mL，检出限为38 CFU/mL，检测时间约80 min。该技术还在田间样品包括生菜样品上进行了测试，结果表明该方法准确，回收率为81.0 -119.2% ，相对标准偏差为3.3% -14.7% 。本研究结果为沙门氏菌的检测提供了一种快速、简便的方法，对今后其他食源性致病菌的检测具有潜在的应用价值。

简评及感悟

沙门氏菌有可能存在于食品生产的各个阶段和整个供应链，它具有高度的传染性，如果不加以控制，它可以迅速导致广泛的感染并产生严重的后果。沙门氏菌的快速、灵敏检测对控制其在食品中的传播起着关键作用。然而目前对细菌的检测方法要么耗时且灵敏度相对较低，要么需要昂贵的设备和训练有素的操作员。针对这些问题，本研究利用噬菌体T156介导的金纳米颗粒聚集，开发了一种新的技术，用于沙门氏菌的可视化和精确鉴定。在高盐浓度下，噬菌体以分散稳定的状态与金纳米粒子结合。当引入沙门氏菌时，噬菌体特别识别并吸附目标细菌，导致金纳米粒子发生变色反应，产生聚集，从而使沙门氏菌可视化。这种技术利用噬菌体作为比色法中的识别元素，使得人们可以简单、快速和有效区分活的和死的沙门氏菌。因为这种方法显示出极高的灵敏度、特异性和准确性，其可为快速检测其他病原菌提供一条新途径。

全文链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267023007225