噬菌体是生物技术和医学领域中不可或缺的生物资源。然而，缺乏快速工程化、组装、包装基因组和选择噬菌体的方法限制了Vincent Noireaux等人利用这些资源的能力。无细胞转录-翻译(TXTL)提供了实验设置来解决这一限制。在这里，Vincent Noireaux等人描述了使用T7噬菌体基因组和大肠杆菌TXTL的噬菌体，工程化通过体外基因表达和选择(Phage Engineering by In vitro Gene Expression and Selection，PHEIGES)。噬菌体基因组是通过体外从PCR扩增的片段组装而成，并在批量TXTL反应中直接表达，以在一天之内产生高达10^11 PFU/mL的工程化噬菌体。Vincent Noireaux等人进一步证明了在大量TXTL中噬菌体组装的显著基因型-表型联系。这使得能够快速选择具有改变的粗脂多糖特异性的噬菌体，这些噬菌体来自包含尾纤维突变体库的噬菌体基因组。Vincent Noireaux等人通过一锅法组装这些突变体并整合荧光基因以及缩短10%的基因组长度，建立了PHEIGES的可扩展性。

　　TXTL系统制备

　　简要来说，大肠杆菌细胞在添加了磷酸盐培养基中生长。细胞经离心收集、洗涤后，用细胞破碎仪裂解。离心后，回收上清液，并在37 ℃下孵育80 min。经过第二次离心后，将上清液在4 ℃下透析3 h。最后一次离心后，将上清液分装并储存在- 80 ℃。TXTL反应体系包含细胞裂解物、能量和氨基酸混合物。

　　DNA组装和TXTL反应

　　简要而言，将纯化的PCR片段以0.5 - 5 nM的等摩尔浓度混合。在冰上，将等体积的 2×组装混合液(20 mM Tris - HCl，pH 7.9;100 mM NaCl;20 mM MgCl₂;10%(w/v)聚乙二醇 8000;2 mM 二硫苏糖醇;1 U/μL 核酸外切酶 III)与2.5 μL的DNA混合物混合。将装有组装混合物的试管从冰上转移至75 ℃的水浴中，孵育1分钟。在75 ℃下孵育1分钟后，将试管置于室温下再孵育5分钟，以使具有单链末端的DNA片段退火。将该混合物直接加入到TXTL反应体系中。通常，将2.5 μL的组装混合物加入到7.5 μL的TXTL反应体系中。阴性对照的设置是将除其中一个片段外的所有PCR片段混合，并用等体积的水替代被排除的那个片段。

　　图1展示了PHEIGES的工作流程，这是一个无细胞的噬菌体基因组工程、合成和选择的快速全流程。首先，噬菌体基因组通过PCR被扩增成12 kbp或更小的片段，并带有重叠的DNA序列。在任何允许的位点引入基因添加(绿色)、突变(橙色)和删除(红色虚线)。PCR产物经过清理，短暂消化以创建粘性末端，然后在体外进行退火。DNA组装反应直接加入到无细胞合成(CFS)反应中，以产生噬菌体。在期望的宿主上对工程噬菌体进行扩增和滴定(PFU：斑形成单位)。直接使用工程噬菌体进行NGS分析和下游应用。整个流程在一天之内就可以完成，能够产生与细菌裂解液中获得的滴定结果相当的噬菌体(10^10 - 10^11 PFU/mL)。这个流程不仅快速，而且避免了细胞扩增或其他合成手段的需要，实现了基因型与表型之间的直接联系。

　　图2展示了PHEIGES技术在T7噬菌体基因组重建和基因插入方面的应用。展示了用于重建T7野生型(WT)基因组的四个DNA片段(T7A、T7B、T7C和T7D)，这些片段通过特定的设计可以重新组装成完整的T7基因组。说明了mCherry荧光报告基因被插入到T7基因组的三个不同位置(基因1下游、基因10下游和基因17下游)，用以创建带有mCherry标记的T7噬菌体变体。展示了带有mCherry标记的T7噬菌体感染宿主细胞并表达mCherry蛋白的过程，这有助于通过荧光显微镜观察噬菌体的感染和复制。通过监测培养物的光密度(OD600)和在625 nm处的荧光强度，展示了T7-mCherry噬菌体感染E. coli B细胞的动态过程。图中的曲线显示了感染过程中细胞密度和荧光强度的变化。图2通过实验数据和图像，直观地展示了PHEIGES技术在噬菌体基因组工程中的应用，包括基因组的重建、外源基因的插入以及感染动力学的监测。这些结果证明了PHEIGES技术在快速、高效地进行噬菌体工程方面的潜力。

　　图3展示了使用PHEIGES技术对T7噬菌体基因组进行尺寸缩减的实验结果。研究人员通过有针对性地删除T7基因组中的非必需基因序列，成功减小了基因组的大小。这些基因被分为早期基因(class I)和DNA代谢及复制相关的基因(class II)，而对结构基因(class III)没有进行删除，因为它们被认为是必需的。研究设计了六种潜在的基因删除组合(del1到del6.图3所示)，并通过PCR扩增与这些删除区域相邻的片段，使用具有正交重叠序列的引物，以桥接被删除区域周围的片段。通过一轮单次删除PHEIGES实验，筛选出可行的噬菌体，并将它们组合起来，最终创建了一个体积为35.8 kbp的“T7-mini”基因组。尽管T7-mini噬菌体的基因组尺寸减小了，但它仍然保持了对自然宿主E. coli B的感染能力。图中显示了T7-mini噬菌体在E. coli B菌落上形成的清晰、圆形的斑块。通过比较T7野生型(39.9 kbp)和缩减后的T7-mini(35.7 kbp)噬菌体在E. coli B菌落上的斑点，可以直观地看到基因组缩减对噬菌体感染能力的影响。总的来说，图3展示了PHEIGES技术在噬菌体基因组工程中的应用，特别是在基因组尺寸缩减方面的潜力，以及这种缩减对噬菌体功能的影响。通过这种方法，研究人员能够创建更小、更易于操作的噬菌体基因组，同时保持其生物学功能。

　　图4展示了TXTL反应中，T7噬菌体的基因型(genotype)和表型(phenotype)之间的联系。以下是图4的主要内容总结：通过设计一个实验，其中两种T7噬菌体变体(T7-vWT和T7-rfaD-1)的基因组在同一个DNA组装反应中退火，以测试在没有物理分隔的情况下，噬菌体的基因型和表型之间是否存在耦合。实验中，T7-vWT和T7-rfaD-1噬菌体变体的基因组片段以等摩尔比例混合，并在TXTL反应中共同表达，预期在没有基因型和表型耦合的情况下，会产生六种不同的基因型和表型组合。通过在不同的宿主菌株上进行噬菌体滴定，以及使用纯化的ReLPS(粗糙型脂多糖)来选择性地抑制具有突变尾纤维的噬菌体，实验结果与完全随机化的假设(即尾纤维的组合是随机的)进行了比较。实验数据显示，纯合子基因型和表型(wt/WT和mut/MUT)的比例远高于随机混合假设所预测的比例，表明在PHEIGES中存在显著的基因型和表型耦合。实验还测试了在不同比例的突变和野生型尾纤维基因组片段共表达时，噬菌体的表型分布，进一步证实了基因型和表型之间的耦合。图4的结果支持了在无细胞环境中，噬菌体基因型和表型之间存在一定程度的耦合，这对于噬菌体展示和定向进化等应用具有重要意义。

　　图5展示了使用PHEIGES技术来工程化T7噬菌体，使其能够感染带有不同类型粗糙脂多糖(ReLPS)的E. coli菌株。研究人员使用T7野生型(WT)基因组的五个部分(T7A、T7B、T7C、T7D1、T7D2)以及通过突变PCR扩增得到的尾纤维基因17的片段(E0)，来组装T7基因组。展示了如何将T7基因组与E1、E2、E3这三个不同突变负荷的库分别组装，并在TXTL系统中表达，然后将含有噬菌体库的TXTL反应直接点样在含有ReLPS的E. coli菌株上。通过NGS(下一代测序)分析，确定了四个突变尾纤维DNA片段的突变频率。图表显示了基因17的1146-1662位点的突变情况。展示了从感染lpcA、rfaC和rfaE菌株的T7变体中选出的噬菌体的尾纤维序列的突变情况。图中的蓝色区域表示尾纤维尖端的外环，灰色条表示沉默突变，红色条表示非沉默突变。展示了感染lpcA、rfaC和rfaE菌株的T7变体中检测到的所有突变的热图，以及导致ReLPS感染的最常见氨基酸突变。图5通过实验数据和序列分析，展示了PHEIGES技术在快速生成和鉴定具有改善宿主范围的噬菌体变体方面的有效性。这些变体的鉴定为噬菌体治疗和生物技术应用提供了新的策略。

　　图6展示了使用PHEIGES技术来构建一个综合性的T7噬菌体基因组(称为T7-compilation)，这个基因组整合了多个编辑，包括基因的删除、插入以及尾纤维的突变，以实现对特定宿主菌株的感染。以下是图6的主要内容总结：图中展示了T7-compilation基因组的设计，它结合了三个编辑：特定基因的删除(del 2. 3. 4)、在基因10下游插入mCherry报告基因，以及尾纤维的突变，以使噬菌体能感染带有粗糙脂多糖(ReLPS)的菌株。通过监测感染E. coli突变株rfaC的培养物的光密度(OD600)和mCherry荧光强度，展示了T7-compilation噬菌体的感染动力学。这些数据反映了噬菌体感染和复制的过程。通过荧光显微镜图像展示了感染rfaC菌株的T7-compilation噬菌体。图像显示了噬菌体与宿主细胞的相互作用，以及mCherry荧光蛋白的表达，从而验证了基因插入和尾纤维突变的成功。通过感染实验和显微成像，确认了T7-compilation噬菌体具有预期的表型，即能够感染ReLPS菌株，并且表达了mCherry荧光蛋白。图6通过实验数据和图像，直观地展示了PHEIGES技术在构建具有多重编辑的复杂噬菌体基因组中的应用，以及这些编辑如何影响噬菌体的感染特性和宿主范围。这些结果证明了PHEIGES技术在快速、高效地进行噬菌体工程方面的潜力。

　　讨论

　　PHEIGES提供了一种快速、技术上易于访问且低成本的噬菌体工程方法。与现有的体内方法和其他无细胞噬菌体工程方法相比，PHEIGES在DNA组装效率上具有显著优势。PHEIGES能够实现多个基因的删除和插入，这证明了该工作流程的多功能性和可访问性。除了T7和T4噬菌体，PHEIGES还能够在TXTL系统中表达大肠杆菌噬菌体T6和VpaE1.以及沙门氏菌噬菌体FelixO1和S16.这表明PHEIGES可能适用于多种噬菌体的工程。PHEIGES避免了在活细胞中传播的步骤，这减少了由于宿主细胞的抗噬菌体系统和代谢而产生的偏差，并且能够更有效地探索突变。此外，还将探索PHEIGES在噬菌体展示和其他应用中的潜力。

　　参考文献：Levrier, A., Karpathakis, I., Nash, B. et al. PHEIGES: all-cell-free phage synthesis and selection from engineered genomes. Nat Commun 15. 2223 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-46585-1