一种肠球菌噬菌体衍生酶可抑制移植物抗宿主病

中文题目：一种肠球菌噬菌体衍生酶可抑制移植物抗宿主病

期刊及年份：Nature 2024.10

通讯作者：Satoshi Uematsu，主要从事有菌群失调导致的一些疾病及基于噬菌体的防控研究。

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07667-8

摘要：肠道微生物组的变化在异基因造血细胞移植（allo-HCT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病机制中起着关键作用。然而，安全解决肠道菌群失调的有效方法尚未确立。与菌群失调相关的肠道病原体粪肠球菌的扩增已被证明是 aGVHD 的一个风险因素。在此，我们分析了 allo-HCT 患者的肠道微生物组，发现粪肠球菌通过形成生物膜而非获取耐药基因在肠道中逃避清除并增殖。我们从粪便样本中分离出溶细胞素阳性的高致病性粪肠球菌，并通过分析细菌全基因组测序数据鉴定出一种源自粪肠球菌特异性噬菌体的抗粪肠球菌酶。这种抗菌酶在体外和体内对粪肠球菌的生物膜均具有裂解活性。此外，在 aGVHD 诱导的、定殖有粪肠球菌或以来自患者的、以肠球菌占主导的粪便样本的无菌小鼠中，与对照组相比，用粪肠球菌特异性酶处理的组中肠道溶细胞素阳性粪肠球菌的水平降低，存活率显著提高。因此，施用一种对形成生物膜的致病性粪肠球菌具有特异性的噬菌体衍生抗菌酶（这种粪肠球菌难以用现有抗生素消除），可能为预防 aGVHD 提供一种方法。

主要内容：

急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血细胞移植（allo-HCT）治疗血液系统疾病的一种危及生命的并发症。接受 allo-HCT 的患者会经历许多临床干预措施，如化疗、放疗和抗生素治疗，这些都可能影响 aGVHD 的发病机制。多条证据表明微生物组对 aGVHD 有重要影响。20 世纪 70 年代初，在无菌条件下接受 allo-HCT 的小鼠被发现比常规小鼠发生 GVHD 的几率更低。随着肠道微生物分析技术的进步，临床研究报告称与疾病相关的肠道环境改变（如菌群失调）与 aGVHD 症状密切相关。在菌群失调的情况下，一些共生菌会获得致病特征、增殖并直接参与疾病的发生和发展。这些细菌被称为 “致病共生菌”，例如克罗恩病中的黏附侵袭性大肠杆菌以及肥胖和糖尿病中的多枝梭菌。肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌，是在患者中检测到的代表性病原体。粪肠球菌和屎肠球菌是多重耐药感染的重要原因，也是 allo-HCT 患者血流感染的原因之一。先前的研究还揭示了肠道中肠球菌占主导的高发生率，这与 allo-HCT 患者的 aGVHD 发生和较高死亡率相关。特别是，一项研究表明，需要乳糖的肠球菌在 allo-HCT 患者的肠道中增殖，并且粪肠球菌与无菌小鼠模型中 GVHD 的严重程度相关。在这方面，消除 allo-HCT 患者肠道中的肠球菌，尤其是粪肠球菌至关重要。粪菌移植（FMT）有助于解决菌群失调问题。然而，FMT 对 aGVHD 的积极作用尚未得到证实。此外，由于耐药菌的出现以及 FMT 可能传播诺如病毒感染，FMT 的安全性已成为一个严重问题。因此，对免疫功能低下的 aGVHD 患者进行 FMT 可能是有害的。使用抗生素对抗肠道致病共生菌也有通过杀死有益菌而促进菌群失调的风险。因此，为了减轻肠球菌的增加，开发有效且安全的方法来特异性地控制这些生物对于抑制 aGVHD 的发病机制至关重要。噬菌体疗法被认为是消除致病共生菌的一种替代方法，因为噬菌体可特异性感染其宿主细菌。我们之前表明，基于宏基因组分析的宿主细菌 - 噬菌体关联信息有助于检测可特异性调控致病共生菌的噬菌体衍生抗菌酶。这些方法在消除革兰氏阳性菌方面具有广阔的应用前景。

在此，我们提出一种使用杀菌酶 —— 内溶素抑制粪肠球菌相关 aGVHD 的策略。我们纵向筛选了 allo-HCT 患者的肠道细菌组，并从粪便样本中分离出肠球菌。利用鸟枪法测序数据，我们鉴定出一种源自粪肠球菌特异性噬菌体的抗菌酶。我们的结果表明，施用粪肠球菌特异性抗菌酶可抑制 aGVHD 的诱导。

1、allo-HCT 中肠球菌占主导

我们的研究最初招募了 64 例移植病例，但随后有 18 例因提前退出研究或病情迅速恶化而被排除。我们分析中纳入的其余 46 例移植病例至少提供了两份连续的粪便样本。一名患者在我们的研究期间因首次 allo-HCT 后早期白血病复发而接受了两次移植，因此被纳入研究两次。患者的中位年龄为 54.5 岁（范围：19 - 72 岁），其中 25 例（54.3%）为男性。患者的基础疾病如下：26 例（56.5%）患有急性白血病，12 例（26.1%）患有骨髓增生异常综合征或骨髓增殖性肿瘤，7 例（15.2%）患有恶性淋巴瘤，1 例（2.2%）患有其他疾病。在移植方面，10 例（21.7%）病例来自匹配的相关供体，7 例（15.2%）来自匹配的无关供体，11 例（23.9%）来自脐带血，17 例（37.0%）来自半相合供体，1 例（2.2%）来自人类白细胞抗原（HLA）不匹配的无关供体。移植物类型包括 8 例（17.4%）骨髓、27 例（58.7%）外周血干细胞和 11 例（23.9%）脐带血。分别有 24 例（52.2%）、21 例（45.7%）和 1 例（2.2%）病例接受了清髓性、降低强度和非清髓性预处理方案。14 例（30.4%）病例在预处理方案中接受了全身照射。在预处理治疗前，共有 44 例（95.7%）、39 例（84.5%）、3 例（6.5%）和 2 例（4.3%）病例分别预防性使用了氟喹诺酮类、磺胺甲恶唑 - 甲氧苄啶、异烟肼和大环内酯类药物。在样本采集期间，作为经验性或靶向治疗，头孢菌素类（头孢吡肟或头孢唑兰）、哌拉西林 - 他唑巴坦、碳青霉烯类（美罗培南或多利培南）、糖肽类（万古霉素或替考拉宁）或脂肽类（达托霉素）和甲硝唑分别在 21 例（45.7%）、26 例（56.5%）、17 例（37.0%）、28 例（60.9%）和 3 例（6.5%）病例中使用（补充表 1）。每个病例的详细特征总结在补充表 2 中。

我们从 46 例病例中总共获得了 317 份粪便样本。我们从所有这些样本中提取 DNA，并通过 16S 核糖体 RNA（rRNA）基因测序分析其肠道微生物组成（扩展数据图 1a、b）。根据先前的研究，肠球菌占主导定义为粪便样本中肠球菌属的相对丰度超过 25%，在 30 例（65.2%）病例的 89 份样本中观察到这种情况。通过单变量 Cox 比例风险回归分析临床预测因素发现，急性白血病与肠球菌占主导的风险显著高于其他疾病（风险比，2.48；95% 置信区间，1.13 - 5.45，P = 0.024）。没有其他临床变量与肠球菌占主导的累积发生率显著相关。因此，与先前的研究一致，我们的 allo-HCT 患者中存在肠球菌占主导的特征。

2、粪肠球菌的特征

接下来，我们从以肠球菌占主导的粪便样本中分离出 30 株肠球菌，并进行宏基因组分析。我们鉴定出 11 株粪肠球菌和 19 株屎肠球菌（扩展数据图 2a）。几项研究表明，多重耐药菌（如万古霉素耐药肠球菌（VRE））的定植与 allo-HCT 患者死亡率增加相关。因此，我们对分离出的 30 株肠球菌进行了抗菌药敏试验。值得注意的是，所有粪肠球菌和屎肠球菌菌株对万古霉素、替考拉宁、达托霉素和利奈唑胺均敏感，这表明这些细菌菌株不是 VRE，并且与日本分离的肠球菌菌株的标准流行病学特征一致。尽管肠球菌具有多重耐药性，但溶细胞素（一种与溶血素相关的外分泌蛋白）在人类和许多动物模型中都有助于肠球菌疾病的严重程度。我们在所有粪肠球菌菌株中检测到溶细胞素相关基因，如 cylLL、cylA、cylB 和 cylM，但在屎肠球菌菌株中未检测到（扩展数据图 2b）。此外，所有分离出的溶细胞素阳性粪肠球菌菌株均具有功能性溶血活性（图 1a 和补充图 1），这表明高致病性粪肠球菌在 allo-HCT 患者中占优势。此外，尽管在两种肠球菌中都鉴定出了与生物膜形成相关的KEGG直系同源（KO）术语，但一些术语，如 K01791、K07173、K05946 和 K08605 在粪肠球菌中更频繁地被检测到（图 1b）。由于据估计形成生物膜的细菌对抗生素的抵抗力是浮游细菌的 10 到 1000 倍，我们假设溶细胞素阳性的致病性粪肠球菌通过在 allo-HCT 患者肠道中形成生物膜而存活和增殖，从而抵抗治疗过程中使用的各种抗生素的作用。

图1 同种异体hct患者肠球菌菌株的特征

3、一种噬菌体衍生的抗菌酶

由于在 allo-HCT 患者肠道中扩增的粪肠球菌被认为是与 aGVHD 严重程度相关的致病共生菌之一，因此特异性消除这种生物对于抑制 aGVHD 是可取的。然而，生物膜通过降低抗生素渗透性、隔离抗生素和存在持留菌等机制对抗生素表现出强大的抵抗力。因此，用现有的抗生素消除粪肠球菌极其困难。内溶素是噬菌体产生的水解酶，在复制周期结束时溶解细菌细胞壁以释放子代噬菌体。这些酶水解肽聚糖层并杀死宿主细菌。与传统的广谱抗生素相比，内溶素具有宿主特异性高、快速裂解靶细菌、耐药风险低、与不同抗菌剂协同作用以及在生物膜和黏膜表面有效发挥作用等优点。在先前的研究中，我们成功地从艰难梭菌前噬菌体序列的宏基因组数据中鉴定出新的内溶素，并证实了它们在体外和体内对艰难梭菌的杀菌活性。因此，我们接下来分析了与粪肠球菌菌株相关的鸟枪法测序数据（图 1a 和扩展数据图 2a、b），并提取了前噬菌体序列。从每组序列数据中最多可鉴定出四个分类为长尾噬菌体科或短尾噬菌体科的前噬菌体序列（图 2a）。在前噬菌体基因组中筛选与已知内溶素同源的开放阅读框（ORF）（图 2b）。我们从图 1a - c 所示的粪肠球菌菌株的宏基因组数据中鉴定出九种内溶素，所有这些内溶素都被注释为 WP_002399372（E 值 = 0）（补充图 2）。一般来说，内溶素由两个结构域组成 —— 一个酶活性结构域和一个细胞壁结合结构域，它们识别特定的细胞表面特征。检测到的内溶素的酶活性结构域被注释为 GH25（糖苷水解酶家族 25）_LysA 样，这是一种内 - N - 乙酰胞壁酸酶（溶菌酶），通过催化 N - 乙酰胞壁酸和 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺残基之间的 1,4 - β - 键水解来降解细菌细胞壁。检测到的内溶素的细胞壁结合结构域被注释为 ZoocinA_TRD（靶标识别结构域）。我们生成了一种带有 His - SUMO 标签的内溶素（图 2c 和补充图 3），并发现它在体外具有有效的裂解活性（图 2d 和补充图 4）。此外，本研究中分离的所有粪肠球菌菌株的生物膜均被内溶素成功裂解（图 2e）。值得注意的是，内溶素对屎肠球菌或从 allo-HCT 患者粪便中分离的其他肠道细菌（如表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠杆菌）没有有效的裂解活性（扩展数据图 3 - 5），这表明内溶素是一种窄谱酶。此外，在单一定殖有粪肠球菌的无菌 C57BL/6 小鼠中口服内溶素，可有效裂解肠道中粪肠球菌衍生的生物膜（图 2f 和补充图 5）。这些数据表明，从宏基因组数据中的粪肠球菌前噬菌体序列中检测到的内溶素具有裂解肠道中粪肠球菌形成的生物膜的潜力。

图2 由粪肠杆菌特异性噬菌体衍生的噬菌体衍生的抗菌酶裂解生物膜

4、抑制 aGVHD

为了研究施用纯化的粪肠球菌内溶素作为 aGVHD 抑制策略的潜在有效性，我们使用了单一定殖有粪肠球菌的无菌 C57BL/6 小鼠（补充图 6a）。在施用白消安和环磷酰胺后，将骨髓细胞和脾 T 细胞静脉注射到无菌小鼠中以诱导 aGVHD（补充图 6a）。内溶素处理的无菌小鼠粪便中粪肠球菌的水平显著低于载体处理的无菌小鼠（图 3a）。此外，内溶素对 aGVHD 有效（图 3b）。这些发现表明，粪肠球菌衍生的内溶素通过减少肠道粪肠球菌的数量来调节 aGVHD。我们还分析了 GVHD 诱导的、定殖有以肠球菌占主导的人类粪便样本的无菌 C57BL/6 小鼠（图 4a 和补充图 6b）。内溶素处理的人源化小鼠粪便中溶细胞素相关基因 cylLL 的水平始终显著低于载体处理的人源化小鼠（扩展数据图 6a）。在移植前（移植前和第 0 天）和移植后（第 8 天和第 15 天），两组之间的微生物群落没有一致的显著差异（图 4b、c）。然而，与载体处理的人源化小鼠相比，内溶素处理的人源化小鼠血清中干扰素 γ（IFNγ）水平显著降低，存活率提高（图 4d）。总之，这些数据表明，从宏基因组数据中的粪肠球菌前噬菌体序列中检测到的内溶素在 aGVHD 方面具有潜在的临床应用价值。

图3 粪肠球菌噬菌体源性内溶素在单定殖粪肠球菌抗宿主病小鼠体内的分析

图4 人源克隆GVHD培养基中粪肠球菌噬菌体源性内溶素的分析

总结：在这项研究中，我们分析了 allo-HCT 患者的肠道细菌组，揭示了肠球菌的主导地位。从粪肠球菌前噬菌体测序数据中鉴定出的内溶素被证明可裂解形成生物膜的粪肠球菌。施用这种内溶素可根除肠道中溶细胞素阳性的致病性粪肠球菌，并抑制 aGVHD 的恶化。