噬菌体的定向进化：被前噬菌体阻碍

摘要：存在各种定向进化方法，寻求获得具有扩大宿主范围的噬菌体，通常针对噬菌体抗性或非允许的细菌宿主。这些方法的一般前提是在多个细菌宿主上繁殖噬菌体，汇集裂解物，并重复这一过程，直到噬菌体可以在目标宿主上形成斑块。理论上，这会产生含有输入噬菌体及其进化的噬菌体后代的裂解物。然而，在实践中，这种裂解物也可以包括来自细菌宿主的噬菌体。在这里，我们描述了我们实施一种定向进化方法的经验，即Appelmans方案，以研究铜绿假单胞菌噬菌体-宿主系统中的噬菌体进化，在那里我们观察到噬菌体鸡尾酒的宿主范围迅速扩大。进一步的实验和测序显示，观察到的宿主范围扩大是由于来自溶原宿主的Casadabanvirus前噬菌体，仅在前三轮实验中被包括在内。这种噬菌体可以感染最初使用的八种细菌宿主中的五种，使其能够持续存在并增殖，直到实验结束。从Appelmans实验中分离出的噬菌体测序样本中有一半是这种噬菌体，但是尽管受到定向进化条件的影响，它似乎并没有进化。这项工作强调了噬菌体在定向进化实验中的影响，以及基因验证输出噬菌体的重要性，特别是对于那些试图获得用于噬菌体治疗应用的噬菌体的人。该研究还指出，在细菌宿主菌株之间进行种内拮抗试验，可以建立抑制活性的基线，并确定前噬菌体的存在。定向进化是进化噬菌体扩大宿主范围的一种常见策略，通常以致病性细菌菌株为目标。在这项研究中，我们利用铜绿假单胞菌系统中的定向进化研究了噬菌体宿主范围的扩展。我们发现，在定向进化中，噬菌体是积极的参与者，可以帮助观察宿主范围的扩展。由于噬菌体普遍存在于细菌宿主中，特别是致病性细菌菌株中，所有定向进化方法都涉及在一个或多个细菌宿主上迭代繁殖噬菌体，因此噬菌体制剂中存在的噬菌体是实验设计和解释结果时需要考虑的因素。这些结果强调了在菌株选择过程中通过遗传或种内拮抗试验筛选噬菌体的重要性，并将有助于改进未来定向进化研究的实验设计。

引言：噬菌体的定向进化是用来描述促进噬菌体向某些期望的遗传和表型进化的实验方法特征。定向进化方法因宿主呈现策略而异，通常分为三大类：顺序、并行或混合(1)。在所有情况下，定向进化方法的一般策略包括在一个或多个宿主上迭代繁殖噬菌体，然后在生长后收获输出噬菌体裂解物，并将其用作下一轮的输入噬菌体。也被称为噬菌体训练，定向进化的一个目标是获得改变或扩大宿主范围的噬菌体，从而感染噬菌体抗性或其他不允许的宿主(2)。当这一结果实现时，通常是噬菌体积累点突变和/或尾纤维和受体结合基因重组事件的结果（2 - 6）。然而，一些研究表明，表观遗传修饰，特别是DNA甲基化，可以导致噬菌体宿主范围的变化，因为噬菌体适应逃避细菌的防御系统，如限制性修饰。噬菌体可以编码DNA甲基转移酶或改变其甲基化模式以克服抗噬菌体防御系统，从而增强其对新宿主的传染性（7-10）。Appelmans方案是一种定向进化方法，用于扩大噬菌体的宿主范围，用于噬菌体治疗应用（2,11,12）。该方法采用将细菌宿主平行呈现到由两个或多个噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒中，其中噬菌体混合物被连续稀释并允许在单个宿主上繁殖，然后收获汇集的裂解物。然后将混合的噬菌体裂解液再次稀释，并允许在单个宿主上进行可变次数的后续迭代（2,11）。最终目标是获得噬菌体裂解物或单个噬菌体分离物，该噬菌体已进化到感染所需数量的目标细菌宿主。随后的感染增加了共同感染和重组的可能性，从而增加了最终汇集的噬菌体裂解物的多样性潜力，而无需添加新的遗传信息(4)。理论上，当输入噬菌体鸡尾酒在宿主体内繁殖时，汇集的裂解物既包括输入噬菌体，也包括进化的噬菌体后代。在实践中，在随后的几轮中收集汇集的噬菌体裂解物的基本方法导致包括输入噬菌体、它们潜在进化的后代，以及不可避免地包括各种细胞成分和细菌副产物，例如从细菌宿主诱导的常驻噬菌体。许多具有临床重要性的致病菌株在其基因组中携带前噬菌体基因簇（13-15），其中包括隐性前噬菌体、尾蛋白和丝状噬菌体（16-19）。携带噬菌体的宿主（也称为溶原）暴露于丝裂霉素C或紫外光下通常可以诱导噬菌体，尽管由于自发的DNA损伤和参与SOS反应的基因的异质表达，一些噬菌体可能以低水平产生（先前的研究报道诱导率为0.09%至3.1%）（20,21）。原噬菌体可以被宿主维持，因为它们可以提供一些与生存和健康有关的优势，如促进生物膜形成、细菌毒力、对后续噬菌体感染的免疫和水平基因转移（22 - 25）。因此，在定向进化条件下，细菌宿主中原噬菌体的存在可以被认为是额外的“惊喜”遗传输入的来源。尽管噬菌体的普遍存在已经得到了很好的证实，定向进化方法也是常见的做法，但直到最近，噬菌体实验进化过程中的噬菌体诱导现象及其对实验结果或数据解释的潜在影响一直被低估。例如，Vu等人发现在鲍曼不动杆菌噬菌体-宿主系统的Appelmans方案中发生了噬菌体的诱导和进化，并有助于扩大噬菌体混合物的宿主范围（26）。报道和承认前体在定向进化实验中的存在和影响将有助于在未来的研究中改进实验设计。在这里，我们描述了我们使用Appelmans方案研究铜绿假单胞菌噬菌体进化的经验，其中实验早期的噬菌体诱导是观察到的宿主范围迅速扩大的原因。原噬菌体来源于临床分离菌株。由于生长速度缓慢，该菌株随后被从实验中移除。野生型噬菌体具有感染5个目标细菌宿主的能力，使其能够增殖并持续存在到实验结束，尽管其原始宿主被移除。该噬菌体保持高丰度，比输入噬菌体竞争，并且在从实验中分离的噬菌体样本中有一半存在，全基因组测序证实了这一点。进一步的遗传和寄主范围分析表明，尽管这种前噬菌体受到定向进化条件的影响，但在实验过程中，它并没有进化到扩大寄主范围。随着时间的推移，观察到的低频率突变表明这种噬菌体在遗传上是稳定的（27,28）。该噬菌体被发现与已知的溶原广义转导噬菌体Casadabanvirus属的JBD24密切相关（29）。这项工作强调了在定向进化研究中基因验证输入和输出噬菌体的重要性，并为未来定向进化实验的设计提供了警示，特别是对于那些试图获取用于噬菌体治疗应用的噬菌体（30）。我们还概述了种内拮抗试验的效用，以确定由于tailocins或常驻噬菌体潜在的跨株活性。

结果：Using directed evolution to expand the phage host range这项工作的目的是研究在噬菌体宿主范围扩大的背景下噬菌体进化的遗传决定因素。目标是将三种输入噬菌体的宿主范围扩展到非允许宿主，然后确定可能导致表型变化的基因突变。因此，我们努力在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）这一高度优先研究的人类病原体中实施Appelmans方案（实验设计见图1）(2)。我们使用三种温带噬菌体作为输入噬菌体混合物：D3、M6和JM2（31,32）。噬菌体D3属于去病毒属，而噬菌体M6和JM2属于源病毒属。早期对D3的研究表明，这种噬菌体与细胞壁结合，特别是与LPS的o抗原结合，可以在溶原后引起宿主血清型转化，作为对密切相关的重复感染噬菌体的防御（33-35）。M6和JM2的全基因组核苷酸同源性为91%，但与噬菌体D3的同源性<25%。因此，M6和JM2之间可能会重组，但D3不太可能重组。对M6的早期研究表明，这种类型的噬菌体作为初始受体，并在鞭毛收缩时被吸引到细胞表面，与细胞表面接触后开始注射DNA（36）。最初在前三轮方案中使用了五种实验室菌株（三种允许型和两种非允许型）和三种临床分离株（非允许型）。对输入噬菌体的初步宿主范围分析表明，它们可以分别感染两个宿主，即PAO1和PA103或PDO300，总共感染最初选择的8个宿主菌株中的3个。将噬菌体按10倍顺序稀释，并加入每个细菌宿主的相应孔中。孵育过夜后，将每个宿主的所有裂解、清除孔和第一个未裂解、未清除孔汇集在一起，并将裂解液制备为下一轮的输入噬菌体鸡尾酒。

Rapid host-range expansion and lysis of non-permissive hosts阿佩尔曼斯议定书总共执行了九轮。令人惊讶的是，在前四轮传代中观察到噬菌体鸡尾酒在宿主范围内的扩增，清除了非允许宿主PAK（第二轮）和PA14（第四轮）（图2）。由于与实验室菌株相比生长速度较慢，在第三轮之后，三个临床分离株被从实验中移除。为了评估不断进化的噬菌体鸡尾酒在宿主范围内的变化，在第3轮和第9轮后将混合的噬菌体裂解液镀上。将混合后的噬菌体裂解液镀于目标菌株的草坪上，并在单个宿主上通过双菌斑纯化重新分离噬菌体斑块。输出噬菌体的宿主范围分析显示，有5个噬菌体分离株随着宿主范围的扩大，可以在所有五个目标宿主PAO1、PA103、PDO300和非允许宿主PAK和PA14上形成空斑(图3；图S1，面板A)。其中3个噬菌体在第3轮后分离，2个在菌株PAK或PA14的第9轮后分离。临床分离株未见斑块。准备10个感兴趣的输出噬菌体进行DNA提取并提交测序。

Output phages with expanded host range were not derived from input phages使用Illumina Miseq平台对输出噬菌体进行测序，并使用UniCycler重新组装其基因组。然后将输出噬菌体基因组与3个输入噬菌体基因组D3、M6和JM2进行比较。噬菌体D3、M6和JM2的基因组分别约为56 kbp、61 kbp和60 kbp（图S2）。令人惊讶的是，具有扩展宿主范围的五个输出噬菌体的组装（图3:PAK_R3_01， PAK_R9_07, PA14_R3_02， PA14_R3_03和PA14_R9_11）产生的contigs在37 kbp到39 kbp之间，没有一个来自输入噬菌体。因此,我们假设图1(一)实验设计和结果的总结:输入噬菌体鸡尾酒由三个噬菌体(1),可以集体目标细菌的感染和溶解的三个主机用于Appelmans协议(2)。前噬菌体是诱导从临床分离菌株在前三轮(3)能够感染目标菌株的五(4)。这三个临床分离株从Appelmans第三轮后由于缓慢的增长率。原噬菌体持续到第九轮（最后一轮）Appelmans(5)，并构成了从实验中分离出的一半测序噬菌体样本(6)。(B) 96孔板Appelmans方案的实验布局。(1)将输入噬菌体鸡尾酒稀释后作用于每个细菌宿主；(2)过夜孵育结果为裂解、清除孔（绿色）和未裂解、未清除孔（黄色）；(3)将所有裂解孔和第一个未裂解孔（红色轮廓）汇集在一起，作为后续轮次的输入噬菌体鸡尾酒。这些输出噬菌体分离物可能来源于源自阿佩尔曼所用细菌宿主之一的原噬菌体。

Intraspecies antagonism assays revealed the presence of prophage in two host strains为了验证输出噬菌体可能来源于原噬菌体的假设，我们在Appelmans中使用的宿主之间进行了种内拮抗试验。所有最初用于实验的8株铜绿假单胞菌都进行了培养，并接受紫外光和丝裂霉素c的诱导。通过从这些培养物中取出细胞并将所有8株铜绿假单胞菌的上清液滴在草坪上来测量种内拮抗作用。从菌株PA103和临床分离物CI00795的上清液中观察到斑块形成（图4）。我们还观察到8株菌株中有6株的抑制清除区（图S1， B组），这是tailocin活性（也称为假单胞菌中的pyocins）的特征（37,38）。与未暴露的培养物相比，将培养物暴露于诱导剂中并没有产生更高水平的斑块形成或抑制区（图S1， C组），这表明这些噬菌体是在低水平下由宿主自发产生的。来自PA103的上清液只能在菌株PAO1上形成斑块，当样品暴露于氯仿中时，斑块的形成被根除（图S1，面板D）。来自PA103的噬菌体也可能因暴露于热而诱导，因为由该宿主制成的草坪上布满了斑块。菌株CI00795的上清液能够在所有五种实验室菌株上形成斑块，包括两个非允许宿主PAK和PA14，并且对氯仿不敏感（图S1，面板E）。考虑到PA103噬菌体的宿主范围狭窄，并且在整个Appelmans实验中经常使用氯仿来收集和分离噬菌体，我们确定PA103噬菌体不太可能有助于宿主范围的扩大。因此，我们选择临床分离株CI00795进行进一步的分析和测序。

Five output phages are derived from a Casadabanvirus-like prophage in strain CI00795为了确定宿主范围扩大的5株噬菌体分离株的来源，对临床宿主菌株CI00795基因组进行了全基因组测序和杂交组装。使用短读和长读数据的混合组装产生了一个单一的圆形contig，长度为6,360,911 bp （NCBI accession: CP158022, coverage: 234.7×）。对CI00795基因组的基因组分析显示，该宿主携带两个噬菌体，一个约为70 kbp，另一个为37 kbp（图5）前噬菌体是一种类似空心病毒的前噬菌体，在基因之间整合，标记为外-唾液酸酶和tRNA二氢嘧啶合成酶（dusA）（核苷酸位置2,176,677至> 2,240,360）。37-kbp的噬菌体在宿主基因组中出现两次，整合在两个位置：一次在基因phzM和hxlR之间（核苷酸位置为771,168至> 808,371，以下称为“phi_1”），另一次在phzG和标记为DNA切除修复复合物亚基的ORF之间（核苷酸位置为3,795,192至> 3,832,395，以下称为“phi_2”）。序列比对证实5个输出噬菌体样本均来自37kbp的噬菌体。

进一步对CI00795噬菌体phi_1和phi_2的基因组分析表明，该噬菌体属于Casadabanvirus属（图6），利用Blastn对国际病毒分类委员会目前列出的Casadabanvirus属的27个Casadabanvirus NCBI参考基因组的全基因组平均核苷酸同源性为88.9% ~ 99.9%。该属噬菌体，如JDB24，具有线性dsDNA基因组，据报道是温带、转座、转导的噬菌体，在溶原宿主后，可以增强其他对CRISPR敏感的感染噬菌体的斑块形成（29）。它们还可以通过转位整合到多个位置，并且可以在其基因组末端包装多达2 kbp的异质宿主DNA（39）。对CI00795基因组中phi_1和phi_2的提取和比较基因组学显示，它们的长度约为37,204 kbp，差异为6个核苷酸(图S3；表S1)。对来自Casadabanvirus原噬菌体的5个输出噬菌体的变异分析显示，其中4个样品彼此具有100%的同源性（不包括异质宿主DNA区域）（图S3），第5个样品具有99.99%的同源性。在五个输出中，只有两个独特的突变被确定两个整合的噬菌体phi_1和phi_2中不存在的噬菌体。所有五个输出噬菌体在卷尺蛋白上游的5个核苷酸同聚体中都有一个基因间插入的“G”。第五个样本PA14_R9_11在假定的尾纤维或基板蛋白中包含了一个非同义突变。其中3个噬菌体在第3轮分离得到（PAK_R3_01、PA14_R3_02和PA14_R3_03），另外2个在第9轮分离得到（PAK_R9_07和PA14_R9_11）。考虑到在9轮定向进化条件下，该噬菌体的突变频率仍然很低，这表明该噬菌体在遗传上是稳定的（27,28）。

Host-range expansion of the Casadabanvirus prophage did not occur在确定了五个输出噬菌体样本的来源后，我们试图将它们的宿主范围与Casadabanvirus前噬菌体的初始宿主范围进行比较。为了实现这一目标，我们首先使用双琼脂覆盖法将菌株CI00795的裂解液镀在Appelmans中使用的每个菌株上，以观察斑块的形成。然后，我们旨在确定Casadabanvirus前噬菌体和Hollowayvirus前噬菌体的宿主范围。为了做到这一点，我们设计了PCR引物，针对两个噬菌体的大端酶亚基。然后从每个宿主菌株中分离出单个斑块，并使用两组引物进行PCR分析。这种方法使我们能够区分CI00795中每个前噬菌体的宿主范围：Hollowayvirus前噬菌体可以在PAK和PDO300上形成斑块，但从其他菌株中收获的斑块未观察到阳性结果。证实Casadabanvirus前噬菌体在宿主菌株PAO1、PA103、PA14、PAK和PDO300上形成斑块（表S2）双阳性证据。这些结果表明，野生型Casadabanvirus前噬菌体最初可以感染所有五种宿主，尽管它受到定向进化条件的影响，但它没有经历导致宿主范围改变的进化，以对抗所测试的宿主菌株。Three output phages are derived from input phage D3, and two output phages are derived from JM2进一步分析Appelmans实验分离的剩余5个输出噬菌体，从输入噬菌体D3中分离出3个噬菌体（PAO1_R9_9A、PAO1_R9_15和PDO300_R9_23），从输入噬菌体JM2中分离出2个噬菌体（PAO1_R9_9B和PA103_R9_19）。来自D3的三个输出噬菌体彼此100%相同，与输入噬菌体D3的不同之处在于，在残基36/224处插入了一个类似ci的转录抑制基因（位点标签D3p074， D3基因组NC_002484）的n端区域19 bp（图S3A）。SMART分析预测在残基6-60处存在螺旋-turnhelix dna结合结构域。这种插入破坏了阅读框架，并暗示了最终产品的功能改变。先前的研究表明，插入CI抑制因子的n端可以使抑制因子失活，并允许裂解基因的转录（40）。虽然d3衍生的输出噬菌体的宿主范围与输入噬菌体没有区别，但由于CI抑制因子的突变，这些输出噬菌体可能更具毒性。未来的工作将研究这种突变的影响。两个jm2衍生的输出噬菌体与输入噬菌体完全相同，除了一个被注释为结构蛋白的基因突变（M6基因组NC_007809中的位点标记PPM6_gp033）。PA103_R9_19和PAO1_R9_9B在178/331残基（Ser->Arg）上共享一个氨基酸变化。PAO1_R9_9B在该基因内还包含一个来自输入噬菌体M6的154-bp重组区（图S3B）。与JM2输入噬菌体相比，该重组事件导致该区域内9个氨基酸替换。PHYRE2预测表明该蛋白可能是基板复合体（RCBS:8rk3）的一部分，并基于假单胞菌噬菌体JBD30 （PDBe）尾部纤维蛋白gp48的模板建模（41），置信度为100% 90%。Valentova等人最近报道，gp47是噬菌体JBD30基板的一部分，与gp48形成异源二聚体，形成尾纤维，与IV型菌毛结合。他们认为这种相互作用可能通过菌毛收缩将噬菌体定向并运输到细胞表面，然后附着受体结合蛋白（41）。这与之前对噬菌体M6的研究一致，该研究发现，该噬菌体与菌毛相互作用是吸附到宿主细胞表面的第一步（36）。与输入噬菌体JM2和M6（感染PAO1和PA103）相比，PAO1_R9_9B的宿主范围扩大到仅包括一个额外的宿主（PDO300），而PA103_R9_19进化到同时感染PDO300和PAK。未来的工作将在更大的面板上测试这些进化噬菌体的宿主范围。图5铜绿假单胞菌菌株CI00795的基因组图谱。基因组的定位是从复制的起源开始的。Casadabanvirus噬菌体在两个位置整合：一次靠近pyocyanin生物合成蛋白（phzM），另一次靠近吩那嗪生物合成fmn依赖性氧化酶（phzG）。空心病毒的噬菌体整合在tRNA二氢嘧啶合成酶（dusA）附近。pyocin基因簇也存在，位于邻氨基甲酸酯合酶组分I （trpE）和邻氨基甲酸酯合酶组分II （trpG）之间铜绿假单胞菌菌株，以了解这些遗传变化对宿主范围的程度。讨论——“理论上，理论和实践没有区别，而在实践中，理论和实践是有区别的。”——本杰明·布鲁斯特（42岁）噬菌体的定向进化涉及旨在促进遗传和表型变异以获得具有所需特征的噬菌体的方法。理论上，在输入宿主上繁殖的输入噬菌体将进化出具有所需性状的输入噬菌体，这些动力学可以建模并预测结果(1)。然而，在实践中，由于噬菌体-宿主相互作用的复杂动力学和实验条件，定向进化研究可能导致变量和意想不到的结果。前噬菌体是细菌宿主内的休眠病毒基因组，作为一种意想不到的输入可能影响这些结果，如果不加以考虑，可能导致对结果的误解。这种现象给一些应用带来了挑战，同时为他人提供解决方案。例如，在噬菌体-宿主系统中，裂解噬菌体是稀缺的，噬菌体的存在和诱导可以被视为潜在治疗选择的资源。然而，不需要的前噬菌体含量使进化噬菌体的分离复杂化，并可能影响噬菌体用于治疗应用的监管批准。在这里，我们证明了在铜绿假单胞菌噬菌体-宿主系统的定向进化过程中，噬菌体的诱导发生。该噬菌体的存在是导致聚集的噬菌体裂解物在先前不允许的宿主上观察到宿主范围扩展的原因。该噬菌体比输入噬菌体具有更广泛的宿主范围，这使得它能够在整个实验中持续存在，并胜过输入噬菌体，成为最常被分离的噬菌体，即使它起源于的宿主在第3轮之后被从实验中移除。虽然前噬菌体受到定向进化条件的影响，但它似乎没有经历宿主范围的扩展。虽然在定向进化条件下，原噬菌体的诱导和增殖是出乎意料的，但考虑到原噬菌体的性质和普遍性，这并不一定是一个令人惊讶的结果。在过去的二十年中，原核生物基因组的数量呈指数增长（43）。这与数量不断增长的前噬菌体预测程序相结合，已经允许在许多细菌物种中鉴定前噬菌体基因簇。特别是在人类病原体中，噬菌体非常普遍，有些菌株含有多个噬菌体（15,44 - 47）。此外，最近的研究集中在噬菌体的定向进化报道了诱导噬菌体。在鲍曼不动杆菌噬菌体-宿主系统中，观察到噬菌体通过重组进化，导致噬菌体具有扩大的宿主范围（26）。在克雷伯氏菌噬菌体-宿主系统中，只有当培养物暴露于所有三种输入噬菌体时才观察到噬菌体诱导，而当培养物暴露于单个噬菌体时则没有观察到（48）。这些发现，连同目前的研究，提供了在定向进化过程中病原细菌宿主诱导原噬菌体的三个例子。Peter Dougherty的一篇论文也在摘要中指出，宿主范围扩大的噬菌体分离物是从噬菌体进化而来的（49）。在定向进化条件下，噬菌体的诱导和增殖是一种令人着迷的现象，尽管有些不方便；对一些人来说，这是一个令人担忧的问题，但对另一些人来说，这是一个潜在的解决方案。例如，在一些噬菌体-宿主系统中，严格的裂解噬菌体是稀缺的，只有温带噬菌体可用于生物控制或治疗应用（50,51）。如果定向进化方法能够创造条件，允许诱导和重组噬菌体，这可能是一种有用的方法，以获得具有所需宿主范围的进化的温带噬菌体。Appelmans方案先前被证明可以通过假单胞菌噬菌体-宿主系统中的重组来促进宿主范围的扩大(2)(4)也证明了Appelmans方案促进了肠球菌噬菌体-宿主系统中尾部相关基因的点突变和重组事件，导致其目标菌株的宿主范围在15轮中从35%扩展到70%(4)。尽管我们在噬菌体衍生的噬菌体分离物中没有观察到任何重组事件或宿主范围扩展，但我们在jm2衍生的噬菌体中确实观察到一次重组事件和一次点突变。两者都位于一个推测的尾纤维基因中，该基因可能与IV型菌毛的结合有关（41）。该重组事件发生在序列同一性>90%的两个温带输入噬菌体M6和JM2之间，表明Appelmans等定向进化条件可以促进密切相关噬菌体之间的重组事件。尽管使用温带噬菌体进行噬菌体治疗一直存在争议，但鉴于基因工程的进步，这种方法不再是遥不可及的（52-54）。定向进化方法，如Appelmans，可能为进一步研究前噬菌体和温带噬菌体的进化、诱导途径和噬菌体-宿主动力学提供机会，从而扩大可用于治疗应用的噬菌体库。在目前的工作中，在Appelmans期间从临床分离株诱导的噬菌体将被认为是一个有趣的问题，因为Casadabanvirus噬菌体是已知的转座、转导、溶原的噬菌体，不适合用于噬菌体治疗。虽然Casadabanvirus噬菌体在宿主基因组中的存在已被证明可以提高重复感染对CRISPR敏感的噬菌体的毒力，例如噬菌体JBD24(55)，但也有研究表明，该噬菌体的多溶原性可导致被溶原宿主的噬菌体耐药性增加（29）。众所周知，噬菌体携带抗噬菌体防御机制，可以使其宿主受益（25）；然而，一些噬菌体也会干扰这些系统。例如，Casadabanvirus噬菌体DMS3可以阻断宿主体内的抗噬菌体防御机制，也可以阻断菌毛组装，从而抑制以菌毛为受体的噬菌体（56）。如果干扰菌毛组装是Casadabanvirus属噬菌体排除其他噬菌体感染的常见策略，那么CI00795噬菌体有可能能够排除依赖菌毛的噬菌体M6和JM2的感染（36）。考虑到临床分离株中前噬菌体的普遍存在以及定向进化通常应用于具有临床意义的目标菌株，前噬菌体含量的问题值得更多关注。这就提出了一个问题：如何解决不需要的噬菌体内容的问题？很明显，对输入噬菌体和进化的输出噬菌体进行测序是确保进化的噬菌体分离物来源于输入噬菌体，而不是来源于前噬菌体的最可靠方法。否则，从定向进化中分离出的“进化”噬菌体的遗传起源将仍然未知(2)。菌株的测序也很重要，特别是那些用于噬菌体繁殖和噬菌体分离的菌株。拥有宿主的完整基因组序列对于理解可能影响Appelmans结果的驻留噬菌体相关元件（如tailocins和prophages）非常有用。然而，由于资源或时间的限制，对许多细菌的所有目标菌株进行测序是不实际或不可行的。在这里，我们能够利用细菌宿主的种内拮抗试验来筛选潜在的噬菌体和tailocin含量。这是建立跨株抑制活性基线的一个有用的方法，包括寄主范围的常驻噬菌体。在实施Appelmans之前进行该试验也可能有助于选择合适的繁殖组和目标宿主菌株。这些数据也有助于解释假定进化的噬菌体宿主范围测试。另一种方法可能是对Appelmans进行无噬菌体控制，以观察是否由于诱导tailocins或常驻噬菌体而发生裂解。在这里，我们也能够使用PCR有效地筛选斑块，以识别和确定常驻噬菌体的宿主范围。或者，可以设计针对输入噬菌体的特异性引物，并使用PCR快速将聚集的噬菌体裂解液中观察到的斑块形成与噬菌体起源关联起来，以避免追求不必要的噬菌体衍生分离物并保存测序资源。结论：总之，在定向进化实验中，前噬菌体的存在和增殖为寻求获得具有治疗应用所需特性的噬菌体提供了障碍和机会。这些研究加深了我们对噬菌体-宿主基本相互作用的理解。在定向进化研究中，理解和管理前体的存在和影响对于实验设计、资源分配、正确解释结果以及增加有利结果的可能性非常重要。诸如输入和输出噬菌体测序、宿主测序、进行种内拮抗试验以及利用PCR进行噬菌体鉴定等策略可以帮助解决这些挑战。