噬菌体制造革命：无细胞合成与定向进化技术打造高效生产新纪元

无细胞合成M13噬菌体

M13噬菌体仅包含11个基因，合成相对简单。因此作者假设可以在体外无细胞条件环境下实现噬菌体组装（cell-free protein synthesis，CFPS）。因此，研究者提取了大肠杆菌JM109的细胞内容物，通过添加噬菌体颗粒或其基因组DNA来合成M13噬菌体（图1A）。结果表明，噬菌体效价随着时间的推移而增加，用基因组DNA实现的效价比用完整颗粒实现的效价更高。但两种方法的合成效率都低于体内合成，12小时时滴度稳定在¹⁰⁵噬菌斑形成单位pfu/ml（图1B），无法满足定向进化的需求。

改进无细胞合成系统

鉴于与完整颗粒相比，使用基因组DNA的CFPS系统表现更好，研究者测定了用于大规模噬菌体生成的基因组DNA的最佳浓度。结果显示，在浓度为100 ng/μl时系统达到稳定水平（图1C）。为了进一步提高噬菌体体外合成的效率，研究者根据以往的报道对噬菌体基因组进行了简化，以减轻不必要的基因表达的压力。研究者构建了修饰辅助噬菌体（helper phage，HP）质粒（M13KO7-ΔPS-ΔgIII-ΔgVI）包含卡那霉素抗性基因和几乎所有繁殖所需的基因。结果表明，简化后的噬菌粒显着提高了噬菌体的生产速度和产量。滴度在3小时内达到^{108 pfu/ml}，明显快于体内生成（图1D）。为了最大限度地利用宿主细胞中的物质资源，研究者将pUC19质粒中的高拷贝复制起点（origin of replication，ori）pMB1插入HP中，以增加细胞裂解液中噬菌体增殖所需产物的比例。结果显示，携带pMB1可以使无细胞系统中M13噬菌体的滴度达到^{109 pfu/ml}以上的水平，仅略低于体内产量（图 1E）。此外，无细胞系统中的噬菌体生成率比体内高出两到三倍（图1E）。

图1：优化无细胞噬菌体生产系统以实现稳健的噬菌体制备^[1]

开发液滴中的无细胞噬菌体辅助进化（phage-assisted evolution，PAE）方法

上述构建的CFPS系统虽然实现了M13噬菌体的快速高效制备，但由于缺乏进化环境，仍不适合用于定向进化。为了实现进化以供筛选，研究者将GFP基因插入噬菌粒中以可视化噬菌体合成（图2A）。选择最佳浓度1.5-2.5 ng/ml噬菌粒与大肠杆菌JM109的细胞内容物一起嵌入微滴，使10-20%的液滴含有噬菌体产物，以避免多克隆干扰（图2B）。为了测试噬菌体生成的液滴分选的效率，研究者将带有或不带有GFP基因的噬菌粒均匀混合，然后将混合物添加到无细胞系统中进行液滴制备。大约六分之一的液滴表现出GFP荧光，证实含有GFP基因的噬菌粒可以有效地产生荧光蛋白。当通过分选时，几乎所有分选的液滴都表现出绿色荧光，表明这些液滴含有带有GFP的噬菌粒（图2C、D）。

图2：开发液滴中的无细胞噬菌体辅助进化方法^[1]

用于筛选抑制tRNA的无细胞PAE

为了验证无细胞PAE方法的效率，研究者重点研究了抑制tRNA，这是一种可以识别终止密码子以继续合成多肽链的特定tRNA。在噬菌粒的gVI和GFP中引入了色氨酸无义突变（UGG>UGA）作为抑制tRNA活性的传感器（图3A）。在分选前后，有两个TrpT突变（MUT1和MUT2）显着上调。MUT1在未分选的样品中表现出约10000倍的富集，在分选的样品中表现出大于90000倍的富集（占样品的约8.0%）（图3C）。然而，MUT2在未分选的样本中表现出约340倍的富集，在分选的样本中表现出约310倍的富集（占样本的约3.9%）（图3C）。这些结果表明，与MUT2相比，MUT1作为色氨酸抑制tRNA具有更高的性能，并且FADS可以帮助进一步提高无细胞系统中定向进化的效率。

通过测定M13噬菌体的滴度来验证TrpT MUT1抑制 tRNA 的活性可以发现，通过读取终止密码子UGA，这些色氨酸tRNA突变产生的噬菌体数量是野生型的100倍以上（图3D）。使用带有GFP色氨酸无义突变的双荧光蛋白报告系统来检测进化tRNA的活性可以发现，进化tRNA的GFP/RFP强度比野生型高八倍以上（图3D）。这些结果表明，优化后的无细胞噬菌体生产系统可以有效筛选高性能突变体。

图3：使用无细胞噬菌体辅助进化筛选色氨酸抑制 tRNA（TrpT）^[1]

结论

基于CFPS平台，这项研究实现了两个关键目标。首先，构建了目前最佳的M13噬菌体无细胞合成系统，从而能够快速、大量地生成M13噬菌体及其突变体文库。其次，在液滴中开发了一种多功能无细胞PAE系统，擅长筛选性能增强的定向突变体。综上所述，这种基于无细胞系统的新型M13噬菌体合成技术代表了噬菌体应用技术的巨大飞跃。它的实用性和易用性克服了对细胞宿主的传统依赖，使其成为一种变革性工具。

参考文献：

1. Xu B, Liu LH, Lin H, Zhang Y, Huang Y, He Q, Wang F, Wu YR, Zhang Z, Jiang A. A cell-free bacteriophage synthesis system for directed evolution. Trends Biotechnol. 2024 Oct 26:S0167-7799(24)00287-7. doi: 10.1016/j.tibtech.2024.10.005. Epub ahead of print. PMID: 39462751.