河南师范大学杨清香教授团队Water Research｜噬菌体在促进抗生素抗性基因水平转移中的作用

近日，河南师范大学杨清香教授团队在Water Research上发表了题为The Role of Bacteriophages in Facilitating the Horizontal Transfer of Antibiotic Resistance Genes in Municipal Wastewater Treatment Plants的研究论文。基因水平转移一直是生命科学领域的研究热点，也是抗生素抗性基因传播的重要方式。噬菌体作为全球数量最多的生命体，广泛存在于各种生态系统中，但由于噬菌体及其宿主细菌的难培养性、宿主谱的不确定性，导致噬菌体在基因水平转移中的作用经常被忽视。杨清香教授团队从污水处理系统中分别富集噬菌体和多重耐药菌，并建立共培养体系，从群体水平全面研究了噬菌体在基因水平转移中的作用。结果发现，噬菌体通过转导和裂解细菌释放宿主DNA促进转化两种方式在基因水平转移中发挥着重要的作用。同时，从组装获得的686个质粒的分析结果表明，接合转移型质粒占比极低（3.36%），人们广泛关注的接合转移并不是耐药基因水平转移的主要方式。

本研究从污水处理系统中分别富集噬菌体群和多重耐药菌群，并在控制条件下建立二者的共培养体系，探讨噬菌体在ARG转移和传播中的功能。共培养结果表明，尽管细菌群落在整个过程中保持稳定，但噬菌体的加入显著增加了ARGs的丰度，尤其是在噬菌体DNA中。共培养后，11种已鉴定的ARGs中有9种显著增加，表明更多的噬菌体颗粒携带了ARGs。此外，在共培养过程中共检测到686种质粒，其中只有3.36%为接合质粒，这一比例显著低于已报道质粒的平均比例（25.2%，共计14,029种质粒）。研究发现，噬菌体可能通过噬菌体介导的转导作用以及裂解宿主细菌向胞外释放质粒和ARGs促进自然转化，在ARGs的水平转移中发挥重要作用。然而，接合转移可能不是多重耐药细菌获得和传播ARGs的主要机制。本研究与以往研究的不同之处在于，采用了一个多样化的细菌和噬菌体共培养体系，从群体水平评估了噬菌体在环境中ARG转移和传播中的功能，克服了以往细菌和噬菌体难分离、噬菌体宿主特异性的问题。

图1 图文摘要

为评估噬菌体对胞外ARGs及其水平转移的影响，本研究建立了一个包含噬菌体群和多重耐药菌群的共培养体系，并设置一组灭活噬菌体作为对照。结果表明，噬菌体的加入并未显著改变细菌群落的多样性，且细菌群落组成无明显差异。然而，ARGs（如macB、ereA和tetX）的浓度显著增加（p < 0.05）（图2）。这些结果表明，在噬菌体存在的情况下观察到的ARGs浓度增加，可能是由于细菌通过水平基因转移获得了新的ARGs，而不是现有耐药菌株丰度的增加。先前的研究报告显示，从污水、粪便、海水等环境中分离的噬菌体DNA中存在大量的ARGs。在本研究中，共培养后噬菌体中大多数ARGs的丰度显著增加，表明具有高水平基因转移潜力。噬菌体传统上被认为具有狭窄的宿主范围，仅能感染近缘菌株，因此跨物种水平基因转移较为困难。然而，这种传统观念可能并未准确反映噬菌体在不同宿主间感染的实际潜力。宿主范围的狭窄可能是因为受试的受体菌株数量有限，而环境中的细菌多样性极为丰富。近年来的研究表明，某些噬菌体能够感染多种宿主细菌，并在不同菌株间介导基因交换。大规模环境宏基因组和单细胞研究显示，在被感染的细菌中，35–50%是多个噬菌体的宿主。此外，噬菌体携带的ARGs在常见的废水消毒处理（如氯、臭氧和紫外线）过程中表现出高度稳定性，使得转导颗粒能够在环境中长期存在，等待合适的宿主。

图2.共培养过程中ARGs浓度的变化

噬菌体在裂解宿主细菌时释放的DNA是细胞外DNA的主要来源。经过共培养后，添加了噬菌体的实验组胞外DNA中大多数ARGs的浓度显著高于对照组（p < 0.05；11种ARGs中的7种）。这一结果表明，噬菌体可通过增加胞外ARGs促进ARGs的自然转化。质粒具有紧凑的结构，能在细胞外环境中抵御物理和化学损伤，包括高温、紫外线和酶解作用。与线性DNA片段相比，携带ARGs的质粒更易被转移，这是由于质粒的稳定性及其在被细菌摄取后能够独立复制和表达。本研究从宏基因组数据中成功组装出686种质粒，对共培养过程中质粒的变化进行了分析（表1）。通过质粒介导的水平基因转移最广泛的机制为接合和自然转化。然而，本研究中检测到的接合质粒比例（686种质粒的3.36%）显著低于已报道的质粒的平均水平（14,029种质粒的25.2%）。接合质粒通常携带多种自我转移所需的基因，包括松弛酶、IV型耦合蛋白和IV型分泌系统基因，其长度通常超过20 kb。然而，长度超过20 kb的229种质粒中，接合质粒的比例仍然较低。这些发现表明，接合转移可能并非多重耐药细菌获得和传播ARGs的主要机制，而其他机制可能在多重耐药菌群体内获得和传播ARGs中起到更大作用。

表1. 共培养体系中组装的质粒信息

ARGs的转移可通过亲代向子代的垂直转移以及不同微生物之间的水平转移来实现，其中水平基因转移尤为令人担忧。在宏基因组数据分析中，如果在共培养前后样品中完全匹配的contigs上发现具有相同序列的ARG，则很可能是垂直转移的结果。相反，如果基因在共培养后出现在不同的contig中，则可能主要是水平转移的结果。在共培养后，数百个相同的ARGs在不同的DNA片段上被检测到，表明在这一过程中确实发生了水平基因转移。此外，噬菌体的存在增加了此类基因的发生率，表明噬菌体的加入促进了水平基因转移。在共培养前，噬菌体DNA中的5种ARGs在细菌细胞内DNA中未检测到；在共培养后，这些ARGs出现在不同的侧翼序列上，这表明这些基因可能通过噬菌体转导进行了转移。为了进一步验证ARGs的水平转移，从宏基因组数据中鉴定出高质量的宏基因组组装基因组（MAGs）（图3）。这些MAGs中包含大量ARGs，与培养细菌的多重耐药表型一致。值得注意的是，在实验组中，ARGs的数量显著增加。然而，在MAGs中未检测到噬菌体和质粒的序列，这可能是由于GC含量的差异，导致这些序列未被分配至细菌基因组的分箱中。为解决这一问题，本研究采用了geNomad软件直接从宏基因组数据中检测噬菌体，成功检测到其序列。总体而言，qPCR定量结果和宏基因组序列分析表明，细菌中的ARGs在共培养后发生了转移，噬菌体的加入促进了这一过程。

图3. 基于宏基因组组装的基因组及其携带的ARGs

本研究首次通过多样化的噬菌体和细菌共培养体系，揭示了噬菌体在ARGs传播中的作用。噬菌体不仅能够通过转导有效促进多重耐药细菌间ARGs的传播，还能增加胞外DNA中ARGs的浓度。此外，接合转移在细菌耐药性传播中的贡献可能并不像通常认为的那么高，而噬菌体在转导和转化中发挥着重要作用，其在ARGs水平转移中的作用应当给予更多的关注。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0043135424016750