噬菌体通过多种抗防御蛋白克服细菌免疫

摘要：近期研究表明，除了 CRISPR - Cas 和限制系统外，细菌还拥有多种多样的噬菌体抗性系统，但噬菌体如何应对这种多层细菌免疫机制在很大程度上仍是未知的。在此，我们分析了对细菌防御系统敏感性不同的密切相关芽孢杆菌噬菌体群体，并发现了四个不同家族的抗防御蛋白，它们可抑制 Gabija、Thoeris 和 Hachiman 系统。我们证实，当这些蛋白 Gad1、Gad2、Tad2 和 Had1 与相应的防御系统共表达或引入噬菌体基因组时，能够有效地消除防御活性。在感染分类学上不同细菌物种的数百种噬菌体中发现了这些抗防御蛋白的同源物。我们发现抗 Gabija 蛋白 Gad1 可阻断 Gabija 防御复合物切割噬菌体衍生 DNA 的能力。我们的数据进一步揭示，抗 Thoeris 蛋白 Tad2 是一种 “海绵”，可隔离 Thoeris TIR 结构域蛋白在噬菌体感染时产生的免疫信号分子。我们的结果表明，噬菌体编码了一系列抗防御蛋白，能够破坏多种细菌防御机制。

主要结果

细菌与噬菌体的军备竞赛推动了防御系统的进化，使细菌免受噬菌体感染。噬菌体作为回报，发展出了克服细菌防御的机制。多种噬菌体被证明能编码抗限制蛋白，这些蛋白通过直接结合限制酶或掩盖限制位点来抑制限制修饰系统。噬菌体也已知能编码许多CRISPR - Cas抑制剂，其作用机制多样，包括抑制CRISPR RNA的加载、使CRISPR - Cas复合物转向结合非特异性DNA、阻止靶DNA的结合或切割以及许多其他机制。抑制毒素 - 抗毒素介导防御的噬菌体蛋白和非编码RNA也已有描述。早期研究聚焦于限制修饰，后来则集中在CRISPR - Cas作为抵御噬菌体的主要防御机制，而近期研究揭示了数十种先前未知的防御系统，这些系统在细菌和古菌中广泛存在。这些系统通过多种分子机制介导防御，包括小分子信号传导、产生抗病毒化合物以及非编码RNA的逆转录。最近，有几种抑制细菌环状寡核苷酸抗噬菌体信号系统（CBASS）和Thoeris防御系统的噬菌体蛋白已被描述。然而，噬菌体是否以及如何克服新报道的多种防御系统在很大程度上仍然未知。在当前研究中，我们利用密切相关噬菌体的比较基因组学，发现了四个不同家族的噬菌体蛋白，它们能抑制Gabija、Thoeris和Hachiman防御系统。

抗防御基因的鉴定

在先前的一项研究中，我们证明了对表现出对细菌免疫差异敏感性的基因组相似噬菌体进行分析，能够发现一种名为Tad1的噬菌体蛋白，它可抑制Thoeris防御系统。为了检验这种方法是否可用于系统地检测噬菌体中的抗防御蛋白，我们分离并分析了几组密切相关的噬菌体，并测试了它们对几种保护芽孢杆菌免受噬菌体感染的防御系统的敏感性（图1a）。其中一组包括8种新分离的SPβ噬菌体，该组还包括先前分离的噬菌体SPβ、phi3T和SPR。这些是温和的长尾噬菌体科噬菌体，基因组长度约为130千碱基（kb），在比较该组中的噬菌体对时，可比对的基因组占43 - 96%（扩展数据图1a及补充表1和2）。第二组包括6种与噬菌体SPO1相似的噬菌体，SPO1是一种裂解性肌尾噬菌体，基因组长度约为130 kb。在比较该组中的噬菌体对时，超过85%的基因组可比对，在可比对区域具有高（80 - 99%）的序列同一性（图1b及补充表3和4）。第三组噬菌体包括8种先前在近期研究中分离的SBSphiJ噬菌体（扩展数据图1b及补充表5和6）。

图1：基于对防御系统的差异敏感性鉴定抗防御基因。a：本研究中用于检测候选抗防御基因的实验和分析流程图。b：6种SPO1噬菌体的基因组比较。氨基酸序列相似性用灰色阴影标记。使用clinker软件可视化基因组相似性。c：SBSphiJ样、SPβ样和SPO1样噬菌体感染表达Thoeris、Hachiman、Gabija、Septu和Lamassu每种防御系统的枯草芽孢杆菌菌株的感染情况。使用系列稀释噬菌斑测定法测量防御倍数，比较噬菌体在含系统菌株上的铺板效率与在缺乏系统并含有空载体的对照菌株上的铺板效率。数据表示三次重复的平均值。单个噬菌斑测定的详细数据见扩展数据图2。

我们接下来用这25种噬菌体感染表达上述研究中描述的每种防御系统的枯草芽孢杆菌菌株。其中五种系统对至少一种测试的噬菌体具有防御作用（图1c）。然而，同一组的噬菌体在感染含防御系统的细菌时表现出显著不同的特性。例如，Gabija防御系统对噬菌体SPβ和SPβL8提供了强大的保护，但对SPβ组的其他噬菌体（如SPR和phi3T）无效；Hachiman防御系统对SBSphiJ组的所有噬菌体都有防御作用，除了SBSphiJ4（图1c）。为了确定可能解释差异防御表型的噬菌体基因，我们分析了克服每种防御系统的噬菌体群体中的基因含量，并将其与被该系统阻断的噬菌体中的基因含量进行比较。在克服防御系统的噬菌体中常见，而在被防御系统阻断的任何噬菌体中都未发现的基因，被视为候选抗防御基因，并进一步进行实验检测。

抑制Gabija的噬菌体基因

Gabija是一种广泛存在的细菌防御系统，在超过15%的已测序细菌和古菌基因组中均有发现。该系统由两个基因gajA和gajB组成，分别编码一种DNA内切酶和一种类似UvrD的解旋酶结构域。已表明Gabija系统可抵御多种噬菌体。将来自蜡状芽孢杆菌VD045的Gabija系统克隆到枯草芽孢杆菌内时，它对SPβ组的一些噬菌体（包括SPβ和SPβL8）提供了强大的保护，对噬菌体SPβL6和SPβL7则提供了中等、较弱的防御（图1c和扩展数据图2a）。SPβ组的其余七种噬菌体能够完全克服Gabija介导的防御。我们发现有两个基因存在于这七种克服Gabija的噬菌体中，但在对Gabija防御敏感的噬菌体中缺失（图2a，扩展数据图1a和补充表7）。其中一个基因（开放阅读框129（ORF129）；补充表7）在与Gabija共表达时未显示出抑制Gabija的表型，并且我们无法将第二个基因（ORF128）克隆到表达Gabija的细胞中，推测可能是由于毒性。为了检测未克隆的ORF128基因的可能功能，我们从噬菌体phi3T的基因组中敲除了该基因。我们的结果表明，敲除了ORF128的phi3T不再能够克服Gabija防御，这表明该基因可抑制Gabija。我们将此抗Gabija基因记为gad1（Gabija抗防御1）。将来自phi3T的gad1及其天然启动子导入到天然缺乏该基因的噬菌体SPβ的基因组中，使SPβ对Gabija产生抗性，证实了gad1对于抗Gabija表型既是必要的也是充分的（图2b）。

图2：Gad1和Gad2蛋白抑制Gabija防御。a：SPβ组噬菌体中的抗Gabija位点。氨基酸序列相似性用灰色阴影标记。使用clinker软件可视化基因组相似性。b：从噬菌体phi3T中删除gad1会消除该噬菌体消除Gabija介导防御的能力，而将gad1敲入噬菌体SPβ会使该噬菌体对Gabija产生抗性。数据表示每毫升噬菌体感染对照细胞（无系统）和表达Gabija防御系统的细胞所形成的噬菌斑形成单位（PFU）。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。c：Gad1同源物的系统发育和分布。在原噬菌体中发现Gad1同源物并经实验验证的细菌名称在系统发育树上用青色菱形标注。d：噬菌体感染实验的结果。数据表示每毫升SPβ感染对照细胞（无系统）、表达Gabija系统的细胞（Gabija）以及共表达Gabija系统和Gad1同源物的细胞所形成的PFU。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。e：Gad1阻断Gabija介导的DNA切割。将纯化的Gabija（GajAB）复合物，或从希瓦氏菌噬菌体1/4中与Gad1共纯化的Gabija（GajAB + Gad1）与先前描述的来自噬菌体λ的DNA底物一起孵育。显示的是来自三次独立蛋白质与DNA孵育1、5、10、15或20分钟的实验的代表性琼脂糖凝胶电泳图。f：从噬菌体SPβL7中敲除gad2会使该噬菌体对Gabija防御敏感，而表达来自侧孢芽孢杆菌原噬菌体的Gad2同源物可使SPβ克服Gabija介导的防御。噬菌体感染实验的操作与图2d相同。

Gad1是一种由295个氨基酸（aa）组成的蛋白质，其与已知功能的蛋白质没有序列相似性。我们发现了94个Gad1的同源物，分布在感染来自变形菌门和厚壁菌门宿主细菌的各种噬菌体和原噬菌体的基因组中（图2c和补充表8、9）。值得注意的是，许多含有Gad1的原噬菌体整合在也编码Gabija系统的细菌基因组中，这表明Gad1使这些噬菌体能够克服其宿主的Gabija介导的防御（图2c）。从感染希瓦氏菌、肠杆菌罗根坎普氏菌、大肠杆菌、胶质芽孢杆菌和厦门芽孢杆菌的噬菌体中选取了五个Gad1同源物，作为Gad1家族系统发育多样性的代表进行进一步的实验检测（图2c和扩展数据图3a）。与来自噬菌体phi3T的Gad1蛋白不同，这五个同源物中的四个在含有Gabija的细胞中表达时没有毒性（除了从厦门芽孢杆菌原噬菌体克隆的同源物）。当在含有Gabija的细胞中共表达时，这四个同源物中的每一个都能有效地抑制Gabija防御（图2d和扩展数据图3b）。最近有研究表明，Gabija可识别并切割具有特定近回文序列基序的DNA，该基序源自噬菌体λ。通过纯化GajA和GajB并在体外重构Gabija复合物，我们能够证实Gabija可切割含有特定序列基序的DNA（图2e）。在有Gad1存在的情况下纯化的Gabija无法切割DNA（图2e）。在一篇相关论文中，我们表明Gad1以八聚体形式结合Gabija复合物，并抑制其结合和切割DNA的能力。我们接下来研究了噬菌体SPβL6和SPβL7，它们缺乏gad1但仍对Gabija有部分抗性（图1c）。值得注意的是，这些噬菌体在其他噬菌体编码gad1的相同位点编码了另一个功能未知的基因。从噬菌体SPβL7中敲除该基因会使该噬菌体完全对Gabija敏感（图2f）。来自SPβL7的该基因在细菌中表达时具有毒性，但将来自侧孢芽孢杆菌原噬菌体的一个无毒同源物与Gabija共表达可完全抑制Gabija防御，进一步证实了它是一个抗Gabija基因，我们在此将其记为gad2（图2a、f）。Gad2是一种由400个aa组成的蛋白质，它与Gad1或其他已知蛋白质没有序列相似性。同源性搜索确定了170个Gad2的同源物，它们几乎总是存在于感染不同宿主细菌的噬菌体和原噬菌体的基因组中（扩展数据图4a和补充表10、11）。值得注意的是，使用Alphafold2进行的结构分析预测Gad2是一种具有核苷酸转移酶蛋白结构域的酶，这表明它通过与Gad1不同的作用机制抑制Gabija（扩展数据图4b）。对预测构成侧孢芽孢杆菌Gad2核苷酸转移酶结构域活性位点的残基进行点突变，会使Gad2失去活性，这表明核苷酸转移酶活性对于抗防御功能是必要的（扩展数据图4c）。纯化的侧孢芽孢杆菌Gad2在体外不与Gabija复合物结合，也不抑制DNA切割，这意味着Gad2可能在Gabija上游起作用，以修饰被GajA - GajB防御复合物感知的噬菌体分子（扩展数据图4d - f）。综合来看，我们的结果表明，SPβ样噬菌体在其基因组的特定位点编码抗Gabija基因，该位点可容纳多个不同的抑制Gabija的基因。

抑制Thoeris的噬菌体基因

Thoeris防御系统存在于约4%的已测序细菌和古菌基因组中。该系统编码ThsB，一种具有Toll/白细胞介素 - 1受体（TIR）结构域的蛋白质，作为噬菌体感染的传感器，以及ThsA，一种切割NAD + 的蛋白质。在噬菌体识别后，Thoeris的ThsB蛋白会产生1″–3′ gcADPR，一种激活ThsA的信号分子，导致NAD + 的消耗并抑制噬菌体复制。我们最近发现了抗Thoeris基因tad1，它是一种存在于噬菌体SBSphiJ7中但在SBSphiJ组的其他噬菌体中不存在的1″–3′ gcADPR海绵，这解释了SBSphiJ7对Thoeris的不敏感性（图1c和扩展数据图2c）。我们推测噬菌体SPO1和SPO1L3也可能编码tad1的同源物，因为这些噬菌体部分逃脱了Thoeris介导的防御（图1c和扩展数据图2b），但我们未能在这些噬菌体中识别出tad1的同源物。相反，我们在SPO1和SPO1L3中发现了一个单独的基因，该基因在所有其他对Thoeris敏感的SPO1样噬菌体中不存在（图3a和补充表7）。我们将这个基因（在此记为tad2）在也表达来自蜡状芽孢杆菌MSX - D12的Thoeris系统的枯草芽孢杆菌细胞中进行表达。tad2强烈抑制了Thoeris的活性，使得对Thoeris敏感的噬菌体能够感染表达Thoeris的细胞（图3b）。此外，将tad2导入到通常被Thoeris阻断的噬菌体SBSphiJ中，结果得到一个能够克服Thoeris介导防御的噬菌体（图3b）。使用失活的Cas9（dCas9）在SPO1中沉默Tad2的表达，进一步证实了Tad2是导致SPO1抑制Thoeris表型的原因（图3b、c）。

图3：Tad2蛋白抑制Thoeris防御。a：噬菌体SPO1和SPO1L3中抗Thoeris基因tad2的基因组位点，以及噬菌体SPO1L4和SPO1L2中的相应位点。氨基酸序列相似性用灰色阴影标记。使用clinker软件可视化基因组相似性。b：Tad2的抗Thoeris活性。数据表示每毫升噬菌体感染对照细胞（无系统）、表达Thoeris系统的细胞（Thoeris）以及共表达Thoeris系统和来自SPO1的tad2基因的细胞（Thoeris + Tad2）所形成的PFU。还展示了噬菌体SBSphiJ以及带有tad2敲入的SBSphiJ的数据。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。c：tad2的敲低会取消抗Thoeris活性。数据表示每毫升感染表达Thoeris并带有靶向tad2的dCas9系统的细胞以及对照细胞的SPO1所形成的PFU。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。d：噬菌体和原噬菌体基因组中Tad2同源物的系统发育分析。在原噬菌体中发现Tad2同源物并经实验验证的细菌名称在系统发育树上用青色菱形标注。

Tad2是一种短蛋白（89 aa），含有一个DUF2829蛋白结构域。序列同源性搜索在综合微生物基因组和宏基因组肠道病毒数据库中识别出了超过650个同源物（补充表12、13）。系统发育分析显示，Tad2由属于几种噬菌体形态组的噬菌体编码，包括肌尾噬菌体科、短尾噬菌体科和长尾噬菌体科，以及由整合在来自6个不同门的100多种细菌物种中的原噬菌体编码（图3d）。我们选取了五个Tad2同源物，代表该家族的系统发育多样性，并将它们分别克隆到表达Thoeris系统的枯草芽孢杆菌细胞中（图3d和扩展数据图5a）。这五个Tad2同源物中的四个能够抑制Thoeris，包括来自感染诸如瘤胃球菌属、马里德斯氏硫杆菌等远距离生物的噬菌体的同源物（扩展数据图5b）。这些结果表明，Tad2代表了一大类被噬菌体用来抑制Thoeris防御系统的蛋白质。在噬菌体感染过程中，ThsB会产生1″–3′ gcADPR信号分子来激活ThsA。正如预期的那样，将纯化的ThsA与来自SBSphiJ感染的、表达ThsB的细胞的过滤细胞裂解物一起孵育，会使ThsA变成一种强的NAD酶，这表明ThsB在响应SBSphiJ感染时产生了1″–3′ gcADPR，正如先前所示（图4a）。然而，来自同样感染且同时表达ThsB和Tad2的细胞的过滤裂解物在体外未能激活ThsA，这表明Tad2在ThsA的上游起作用（图4a）。

图4：Tad2通过隔离1″–3′ gcADPR取消Thoeris介导的防御。a：表达ThsB或同时表达ThsB和Tad2或不表达ThsB的细胞以感染复数为10感染噬菌体SBSphiJ。使用烟酰胺1,N6 - 乙撑腺嘌呤二核苷酸（εNAD）切割荧光测定法测量纯化的ThsA与过滤裂解物一起孵育时的NAD酶活性。柱状图表示三次实验的平均值，单个数据点已叠加。b：Tad2在变性时会释放结合的1″–3′ gcADPR。显示的是纯化的ThsA与在体外预先与2.4 μM纯化的Tad2孵育10分钟的600 nM 1″–3′ gcADPR一起孵育，然后在25°C或95°C再额外孵育10分钟时的NAD酶活性。对照是不含1″–3′ gcADPR的缓冲液。柱状图表示三次实验的平均值，单个数据点已叠加。c：Tad2与1″–3′ gcADPR复合物的晶体结构概览，以卡通（正面）和表面（侧面）表示。Tad2以同四聚体形式存在，由两个二聚体单元组成（颜色为青色带深蓝色和灰色带深灰色）。非二聚体单体对形成两个凹陷的配体结合口袋，包围着1″–3′ gcADPR。d：两个Tad2单体结合形成配体结合口袋的拓扑图。构成结合口袋的组件用绿色勾勒。每个二聚体亚基贡献一个单体，如卡通表示所示。e、f：围绕腺嘌呤碱基（e）或核糖和磷酸（f）的详细视图，这些残基要么直接与1″–3′ gcADPR相互作用，要么协调位于结合口袋内的关键水分子。构成结合口袋的两个单体各自贡献的残基分别用青色（Tad2a）或灰色（Tad2）来表示。

最近的研究表明，噬菌体可以使用特定的蛋白质来降解或隔离细菌免疫信号分子。在体外将Tad2与1″–3′ gcADPR一起孵育时，未产生可观察到的降解产物，这表明Tad2不是一种切割1″–3′ gcADPR的酶（扩展数据图6a）。为了测试Tad2是否可能作为一种结合并隔离免疫信号的海绵起作用，我们将纯化的Tad2与1″–3′ gcADPR一起孵育，然后将反应在95°C加热以使Tad2变性。变性后的反应很容易激活ThsA，这表明Tad2通过结合并隔离由Thoeris产生的信号分子起作用，并且Tad2的变性会将完整的分子释放回介质中（图4b）。为了支持这一观察结果，我们的尺寸排阻色谱结果显示，预先与1″–3′ gcADPR一起孵育的Tad2表现出明显的迁移率变化（扩展数据图6b）。此外，Tad2在与1″–3′ gcAD在孵育后，其UV260nm/UV280nm的吸收比增加，进一步证实了Tad2将该分子作为配体结合（扩展数据图6b）。我们发现Tad2与1″–3′ gcADPR的结合平衡解离常数（KD）为23.3 nM（扩展数据图6c）。值得注意的是，Tad2不能结合经典的cADPR，这表明Tad2对由ThsB产生的信号分子具有高度特异性（扩展数据图6d）。为了确定1″–3′ gcADPR隔离和Thoeris抑制的机制，我们测定了来自噬菌体SPO1的Tad2在无配体和与1″–3′ gcADPR结合状态下的晶体结构（扩展数据表1）。我们还测定了与1″–3′ gcADPR结合的Tad2以及来自肉毒梭菌原噬菌体的Tad1与1″–3′ gcADPR结合的晶体结构（扩展数据表1）。Tad2的结构显示出一种同四聚体组装形式，这与尺寸排阻色谱分析中观察到的寡聚化现象一致（扩展数据图7）。两个Tad2原聚体在螺旋α2和片层β2处聚集形成V形二聚体单元，然后这些单元沿螺旋α1垂直互锁以完成四聚体化（图4c和扩展数据图8）。由此产生的组装体在两个相邻的非二聚体原聚体的界面处形成两个相同的配体结合口袋，周围由一个原聚体的环β1 - β2、环β3 - β4和链β4，以及另一个原聚体的环β1 - β2、环β4 - α3和螺旋α3所包围（图4c - f）。一个1.75 Å的Tad2与1″–3′ - gcADPR复合物的结构解释了信号识别的分子基础。在Tad2 - 1″–3′ - gcADPR复合物中，配体结合是由W25a,b和W73a,b的广泛范德华相互作用，以及N26a,b和D79a,b与磷酸盐和游离羟基的极性相互作用所介导的（图4e,f）。与Tad1 - 1″–3′ - gcADPR复合物相比，Tad2与1″–3′ gcADPR的腺嘌呤碱基形成的接触很少，仅有一个来自T78b的氢键以及来自I63a和T65a的非极性相互作用，而Tad1通过F82b和R109a形成碱基堆积相互作用，并且通过N92b与Hoogsteen边缘形成特定的氢键（图4e、f和扩展数据图8）。此外，我们在Tad2结构中观察到几个关键的水分子，它们有助于1″–3′ gcADPR的结合，并由N26b、D67a、H71a、W73b、S76b和D79a,b进行协调（图4e、f）。Tad2通过相同的结合残基与1″–3′ gcADPR和1″–3′ - 2′ gcADPR结合，并且这两种分子在Tad2结合口袋中的取向几乎相同（扩展数据图8b、c）。尽管Tad2和Tad1在配体识别的分子基础上有所不同，但我们观察到Tad1也在相同的口袋和取向中结合1″–3′ gcADPR和1″–3′ - 2′ gcADPR（扩展数据图8e、f），这突出了这两种蛋白质作为gcADPR分子海绵的作用方式。综上所述，我们的研究结果表明，Tad2通过结合和隔离1″–3′ gcADPR来抑制Thoeris防御，从而阻止Thoeris免疫效应器的激活并减轻Thoeris介导的防御。

抑制Hachiman的噬菌体基因

Hachiman是一种防御系统，其作用机制尚不清楚。它编码一种具有预测解旋酶结构域的蛋白质，以及另外一种没有已知功能结构域的蛋白质。Hachiman在超过3%的已测序细菌和古菌基因组中被发现，并且已被证明能对多种噬菌体提供强大的保护。我们将三个独特存在于噬菌体SBSphiJ4（一种能够克服Hachiman介导防御的噬菌体，见图1c和补充表7）中的短基因克隆到一个表达来自蜡状芽孢杆菌B4087的Hachiman系统的枯草芽孢杆菌菌株中。其中一个基因完全消除了Hachiman介导的防御，因此我们将其命名为had1（Hachiman抗防御1）（图5a、b）。在SBSphiJ4中沉默Had1的表达会导致该噬菌体能够感染对照菌株，但会被Hachiman防御所阻断（图5c）。此外，将带有其天然启动子的Had1导入到SBSphiJ中，使其能够克服Hachiman防御，这表明Had1是导致抗Hachiman表型的原因（图5b）。

图5：Had1蛋白抑制Hachiman防御。a：噬菌体SBSphiJ4中抗Hachiman基因had1的基因组位点，以及噬菌体SBSphiJ7、SBSphiJ和SBSphiJ5中的相关位点。氨基酸序列相似性用灰色阴影标记。使用clinker软件可视化基因组相似性。b：Hachiman对SBSphiJ组噬菌体的差异防以及Had1的抗Hachiman活性。数据表示每毫升噬菌体感染对照细胞（无系统）、表达Hachima系统的细胞（Hachiman）以及共表达Hachiman系统和来自SBSphiJ4的had1基因的细胞（Hachiman + Had1）所形成的PFU。还展示了带有had1敲入的噬菌体SBSphiJ的数据。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。c：had1的敲低会取消抗Hachiman活性。展示的是噬菌体SBSphiJ4感染实验的结果。数据表示每毫升SBSphiJ4感染表达Hachiman并带有靶向had1的dCas9和sgRNA的细胞以及对照细胞所形成的PFU。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。d、e：来自枯草芽孢杆菌Toyonensis的Had1结构概览（d）和表面静电学（e）。Had1是一个同二聚体（颜色为红色和浅灰色），具有由链β1 - β3形成的中央β - 桶状核心以及张开的环，形成一个整体呈平台状的复合物。f：对来自枯草芽孢杆菌Toyonensis的Had1残基I41的放大剖面图（顶部）和序列比对（底部），该残基与来自相对亚基的T11、I16、Y35、A37和A39形成疏水堆积相互作用。g：在二聚体界面中心对Had1进行改变会导致抗防御活性的丧失。数据表示每毫升噬菌体SBSphiJ感染共表达Hachiman系统和来自噬菌体SBSphiJ4的野生型或突变型Had1的细胞以及缺乏Had1的对照细胞和既缺乏Had1又缺乏Hachiman的对照细胞所形成的PFU。显示的是三次技术重复的平均值，单个数据点已叠加。

Had1是一种由53个氨基酸组成的短蛋白，它与任何已知功能的蛋白质都没有序列同源性。我们在芽孢杆菌噬菌体以及整合在芽孢杆菌和类芽孢杆菌基因组中的原噬菌体中发现了23个Had1的同源物（补充表17），并选取了五个涵盖Had1蛋白序列多样性的同源物进行进一步的实验检测。这五个蛋白中的四个有效地抑制了Hachiman的活动，而我们无法将第五个克隆到表达Hachiman的细胞中，可能是由于毒性（扩展数据图9a、b）。这些结果证实了Had1是一类抑制Hachiman的噬菌体蛋白家族。我们测定了来自枯草芽孢杆菌Toyonensis的Had1的晶体结构，揭示出一个同二聚体复合物，其带有两个张开的环，形成一个整体呈平台状的形状（图5d和扩展数据图9c、d）。Had1的二聚体界面由四条β - 链组成，每条亚基贡献两条（图5d）。在Had1复合物平台的中心有一个由链β2中的保守残基（包括R17和K18）形成的带正电荷的斑块（图5e）。在每个亚基的二聚体界面中心的Had1残基I41与来自另一个亚基的五个残基（T11、I16、Y35、A37和A39）形成疏水堆积相互作用，支撑着二聚体界面（图5d）。对SBSphiJ4中Had1的等效异亮氨酸残基进行替换会使该蛋白无法抑制Hachiman，这表明二聚体结构对于Had1逃避宿主抗噬菌体防御是必要的（图5g）。此前有研究表明，噬菌体SBSphiJ可以通过突变其单链DNA结合蛋白来逃避Hachiman防御，并且有人推测Hachiman可能会识别作为噬菌体DNA复制或重组中间产物产生的蛋白质 - DNA复合物。Had1二聚体复合物中心的带正电荷斑块（图5e）可能意味着Had1可能会屏蔽噬菌体复制中间体，使其不被Hachiman系统识别。由于目前Hachiman防御的机制尚不清楚，在未来的研究中理解Had1如何抑制Hachiman可能有助于解开Hachiman防御的机制。在本研究中，我们通过对密切相关的噬菌体基因组进行比较分析，鉴定出了多个家族的噬菌体抗防御蛋白。我们的研究结果表明，噬菌体已经进化出多种策略来对抗复杂的、多层级的细菌防御体系。我们的数据表明，SPβ样噬菌体在其基因组中的一个特定的抗Gabija位点储存抗Gabija基因。这让人联想到在假单胞菌和其他物种的噬菌体中鉴定出的抗CRISPR位点，在每个单独的噬菌体中都存在不同组的抗CRISPR基因。我们在SPβ样噬菌体中发现的特定抗Gabija位点可能指向噬菌体基因组中抗防御基因组织的一个普遍规则，这一基因组现象可以帮助未来对抗防御基因的搜索。在这里发现的分布最广泛的抗防御蛋白家族是Tad2家族，它是一种含有未知功能结构域（DUF2829）的蛋白质。此前曾推测一种含有DUF2829的蛋白质可能会抑制II型CRISPR - Cas系统，特别是Cas9，但并未证明其与Cas9的结合，也未确定该蛋白质拮抗II型CRISPR - Cas的机制。我们的研究结果表明，多个含有DUF2829的蛋白质通过特异性结合和隔离1″–3′ gcADPR来拮抗Thoeris防御系统，这表明DUF2829家族的蛋白质代表的是抗Thoeris蛋白，而不是抗CRISPR蛋白。我们关于Tad2的研究结果与最近发现的其他通过隔离免疫信号分子发挥作用的抗防御蛋白的发现相吻合。这些包括Tad1，一个完全不同的抑制Thoeris的蛋白家族，它与Tad2类似，也结合和隔离gcADPR分子；以及噬菌体编码的Acb2蛋白，它通过结合由CBASS产生的环状寡核苷酸免疫信号分子来抑制CBASS防御。因此，似乎生产能够隔离免疫信号分子的蛋白质“海绵”是噬菌体内部多次并行进化出的一种高效策略，以便成功逃避利用免疫信号分子的免疫系统。这种策略的效率可能看起来违反直觉，因为它需要噬菌体海绵蛋白的数量与免疫信号分子的数量达到1:1的比例（在Tad2的情况下甚至是2:1）。然而，由于Thoeris和CBASS在噬菌体感染周期的相对较晚阶段才变得活跃并产生免疫信号分子，噬菌体在感染的早期阶段有足够的时间来表达大量的海绵蛋白。因此，当防御系统产生免疫信号分子时，感染细胞中已经有足够数量的海绵蛋白来有效地阻断免疫信号。对于噬菌体海绵蛋白效率的另一种解释可能是，与细菌效应器相比，它们对信号分子具有更高的亲和力。我们测量到Tad2与1″–3′ gcADPR的结合亲和力（KD = 23.3 nM；扩展数据图6c）确实比相同分子与Thoeris ThsA的结合亲和力（KD = 59.1 nM）要高，但两者都在纳摩尔亲和力的同一数量级内。我们在所研究的三组噬菌体中未能识别出Septu或Lamassu防御系统的抑制剂，尽管这些组中的噬菌体对这些防御系统表现出差异敏感性。有可能逃避这两个系统是通过现有基因的突变而不是通过存在专门的抗防御基因来介导的。也有可能同一组中的不同噬菌体利用不止一种蛋白质来克服防御，这有时可能会妨碍本研究中使用的分析流程。随着抗生素耐药细菌的出现，噬菌体疗法（即将噬菌体作为抗生素的替代品来使用）正被视为击败细菌病原体的一种合适治疗途径。成功进行噬菌体疗法的一个主要障碍是最近发现的细菌通过编码大量不同的防御系统来积极自我防御的能力。事实上，已经表明给定细菌菌株所携带的防御系统集合是该菌株对噬菌体敏感性的一个重要决定因素。对噬菌体进行工程改造使其携带一组抗防御蛋白可以使其克服细菌防御，从而产生具有更广泛宿主范围的噬菌体，这将更适合用于噬菌体疗法。因此，我们在这里发现的抗防御蛋白，以及已经发现和未来将发现的其他此类蛋白，可以作为更有效进行噬菌体疗法应用的工具。

文献来源：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06869-w