研究背景

微生物世界是一个复杂的相互作用和适应策略的织锦，细菌是其核心。这些单细胞生物表现出高度的适应性，使它们能够在多样和变化的环境中繁衍生息。然而，理解个别细菌如何响应压力和环境变化一直是一个挑战。传统的批量测序方法提供了细菌群体的平均视图，常常掩盖了这些群体内部的异质性。为了解决这个问题，研究者引入了单细胞转录组分析技术（M3-seq），这是一个突破性的技术，它使得细菌单细胞的转录组能够在前所未有的规模和分辨率上进行分析。

M3-seq平台：微生物基因组学的新视野

M3-seq（大规模并行多重微生物测序）是一种专为细菌设计的单细胞RNA测序平台，旨在克服细菌细胞小尺寸、厚细胞壁以及缺乏多聚腺苷酸（poly(A)）尾等挑战。M3-seq代表了细菌单细胞RNA测序（scRNA-seq）的重大进步。

图1. M3-seq单细胞RNA测序平台的建立及rRNA消除

方法和工作流程：M3-seq工作流程从细菌细胞的固定和渗透开始，接着进行原位逆转录，使用带索引的引物。第一轮索引用独特的细胞标识符和分子条形码标记转录本序列。然后，将细胞混合并在液滴中进行第二轮索引，其中第二细胞索引被连接到cDNA分子上。这些索引的组合为单个细胞创建了独特的标记，类似于分子指纹。后续rRNA去除步骤是M3-seq流程中的关键步骤。通过将cDNA库转换成RNA并与rRNA特异性DNA探针杂交，研究者可以使用RNase H选择性地降解rRNA序列。这一过程显著富集了mRNA、tRNA、sRNA和未翻译区域（UTRs）的文库，提供了更全面的细菌转录组视图。

2. M3-seq应用于探索罕见的细菌亚群和噬菌体感染动态

1. 罕见亚群和压力响应

M3-seq发现了表达与细胞内pH升高和谷氨酸代谢相关基因的罕见细菌亚群。例如，研究者鉴定了一个过度表达gadA和gadB基因的E. coli亚群。这些基因对于酸耐受至关重要，即一部分群体准备好承受极端酸压力，可能以整体生长速率为代价。整体结果显示，E. coli在进入早期稳定期时，通过在部分细胞中预先激活gad基因，形成酸胁迫耐受亚群，以应对未来可能的酸胁迫，但基因表达的代谢负担限制了其在种群中的比例。

图2. M3-seq揭示早期稳定期大肠杆菌酸耐受的对冲策略亚群

2. 噬菌体感染异质性

M3-seq还提供了研究噬菌体感染的单细胞层面的独特视角。通过对感染λ噬菌体的E. coli进行转录组分析，研究者观察到了感染结果的显著异质性。一些细胞显示出高水平的λ基因表达，表明发生了裂解性感染，而其他细胞则显示出较低的病毒转录本，突出了噬菌体感染和宿主反应的随机性。

3. 抗生素响应和持久性

将M3-seq应用于不同抗生素处理的细菌培养中，揭示了复杂的转录响应图景。特别是，静止菌剂诱导了多种转录状态，表明细菌生理和药物压力之间存在微妙的相互作用。这一发现强调了在研究抗生素抗性和效力时考虑异质性的重要性。

结论

M3-seq技术的开发为单细胞微生物组学领域带来了重大突破。它不仅能够识别稀有的细菌亚群，还能够详细分析噬菌体感染的异质性。这项技术的应用，使得研究人员能够在更大规模的细胞数量和多种条件下进行转录组分析，为理解细菌群体的复杂行为提供了新的视角和工具。随着M3-seq技术的进一步优化和应用，有望在微生物学、感染性疾病研究以及宿主-病原体相互作用等领域获得更多深入的洞见。

参考文献：Wang, B., Lin, A.E., Yuan, J. et al. Single-cell massively-parallel multiplexed microbial sequencing (M3-seq) identifies rare bacterial populations and profiles phage infection. Nat Microbiol 8, 1846–1862 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01462-3