通过合成生物学和基因组工程增强噬菌体治疗

近几十年来，抗生素在医学和农业中的广泛使用且往往监管不力，这加剧了抗生素耐药病原体的出现。这些多重耐药（MDR）微生物给医疗保健系统带来的负担越来越大，同时开发和储存新型抗生素的制药公司也在减少，这对人类的持续繁荣构成了严峻的威胁。因此，人们对使用噬菌体作为潜在的抗菌疗法重新燃起了兴趣，最近一系列成功的同情用例和即将进行的随机临床试验（例如NCT03808103和NCT04191148）都强调了这一点。然而，体外和临床数据表明，由于噬菌体耐药菌的快速选择，以及长期治疗导致的免疫原性，使用天然噬菌体的噬菌体疗法的效果可能会受到限制，还因为天然噬菌体分离株的宿主范围很少涵盖所有临床相关的致病菌株。

合成生物学的进步，其中工程原理被用来从可互换的部分设计生物系统，以及噬菌体发现的不断加快，可能使天然噬菌体特性的增强能够克服其中的许多缺点。最近的研究描述了自然进化的噬菌体系统以扩大宿主范围并逃避 CRISPR-Cas等宿主防御，表明噬菌体基因组包含天然抗菌机制和产品的宝库，可以添加到合成生物学工具箱中。在这里，回顾了用于将此类成分整合到设计噬菌体中的噬菌体工程技术，这些噬菌体比天然存在的噬菌体具有增强的特性，例如改变/扩大宿主范围以及将治疗性有效载荷基因转导到微生物群内特定靶标的能力。我们还对未来使用人工智能和机器学习方法来设计下一代基于噬菌体的疗法进行了推测性展望。

温带噬菌体基因组稳定整合到宿主染色体中会产生常驻原噬菌体，并且通常能够通过与细菌基因组相同的方法进行病毒操作。相比之下，严格裂解（毒力）噬菌体需要专门的基因组工程方法，这些方法都可以分为两大概念组：1.同源重组 （HR），和2.基因组重启，即激活外源组装的合成噬菌体DNA。

基于重组的方法（图1a），其中噬菌体基因组在感染过程中与细胞质编辑模板进行 HR 驱动的等位基因交换，是噬菌体基因组工程最常用的方法。然而，对于严格裂解噬菌体，这些方法受到自然重组频率低的限制，需要大量筛选才能获得具有所需突变的后代噬菌体。

图1 噬菌体基因组工程方法

为了解决噬菌体基因产物可能对其细菌宿主有毒的问题，已经开发了在天然细菌宿主之外进行基因组组装的合成方法。这些技术依赖于通过转化相关重组（TAR）或体外酶促组装（Gibson 组装）将中小大小的 DNA 片段组装成全长噬菌体基因组，然后转化为感受态细菌宿主以重新启动并组装成突变的噬菌体颗粒（图1b）。从合成 DNA 片段组装噬菌体基因组可实现灵活的工程设计，以在任何基因组位点引入突变、缺失或插入，轻松扩展以进行遗传文库构建，并且无需针对野生型序列进行选择。

噬菌体宿主特异性是一把双刃剑：尽管噬菌体可以选择性地感染和杀死复杂微生物群落中的宿主细菌，但单个噬菌体通常缺乏足够的宿主范围来靶向导致临床感染的所有菌株。多噬菌体混合物可以靶向各种致病菌株，阻止噬菌体耐药突变体的增殖；然而，组成噬菌体的分离和表征非常耗时，并且需要费力的监管批准。为了改善这些限制，合成生物学家现在正在实施宽宿主噬菌体的天然宿主范围扩展机制的设计原则，以实现模块化噬菌体的可扩展合成，基于先前验证的噬菌体支架创建可调宿主范围（图 2a）。

图2 Designer 噬菌体应用

除了工程宿主范围外，噬菌体抗菌活性还可以通过原位产生异源蛋白来增强或调节，异源蛋白通常被描述为遗传“有效载荷”（图2b）。例如，噬菌体已被改造成递送生物膜解聚酶和胶囊解聚酶、群体猝灭酶和具有跨属裂解活性的细胞壁水解酶。受感染的细胞在宿主细胞裂解时产生并释放这些蛋白质，它们作用于附近的靶细胞或底物。最近受到广泛关注的另一组有效载荷蛋白是 CRISPR-Cas 核酸酶。在这里，噬菌体作为靶细胞特异性载体，递送可编程的 Cas 核酸酶毒素，有效地产生核苷酸序列特异性抗菌剂。两项具有里程碑意义的初步研究描述了使用序列特异性crRNA和II-A型效应核酸酶Cas9，靶向大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的抗菌素耐药性或毒力基因的非复制性噬菌粒。噬菌粒递送能够选择性去除耐药或毒性细菌亚群，并可用于免疫含有抗生素耐药基因的质粒。相同的病原体后来也被递送Cas9或Cas3（I-E型）效应子的工程化温带噬菌体靶向。

大数据的出现和新型机器学习（ML）方法的开创构成了生物和医学研究的重大技术进步。虽然上述合理的工程工作是以天然噬菌体系统为模型的，但整合 ML最新进展的合成生物学方法可能会进一步促进噬菌体疗法成为一种可行的临床治疗方法。

将组学与ML驱动的生物信息学相结合的研究已经广泛用于癌症和其他生物医学领域。迄今为止，这些方法在噬菌体治疗学中受到限制，除了少数出版物，这种疏忽很可能是由于在线资源中可用的数据稀缺。就目前而言，任何类别噬菌体最丰富的数据集是放线菌噬菌体集合，包括3400多个完整的基因组序列。一种流行的方法是利用此类数据库中的噬菌体和细菌全基因组序列，以及相应的实验确定的宿主范围信息，来预测病毒与宿主的相互作用（图 3a、b）。虽然放线杆菌噬菌体集合涵盖了足够大的序列空间，可用于ML应用，但这些噬菌体中的绝大多数是在单一细菌物种（耻垢分枝杆菌）上分离的，这大大降低了其适用性。通常，很难获得全面可靠的宿主范围数据，因为它需要劳动密集型实验以及标准化的方案和评分系统，从而可以比较来自不同实验室的宿主范围数据。负相互作用数据（即未被给定噬菌体感染的细菌宿主）尤其代表性不足，这一限制只能通过实施复杂的数据增强方法或对噬菌体特异性做出未经验证的假设来解决。

图3 人工智能驱动的噬菌体研究

正如基于序列、ML驱动的噬菌体研究正在兴起一样，基于结构数据对生物过程的推断和预测也在兴起。除了利用宿主范围信息根据预测的蛋白质-蛋白质相互作用推断噬菌体敏感性，聚糖研究的最新进展同样前景广阔。聚糖构成了细菌细胞表面的很大一部分，通常用作噬菌体附着配体和受体。Bojar等最近的两项研究使用自然语言处理创建了一个全面的聚糖结构数据库，并提供了现成的相关噬菌体结合信息，并推断了细菌种类的进化关系。这为 AI 驱动的噬菌体研究开辟了一个有趣的角度。类似于使用宿主范围信息作为分类标签，这些类型的实验数据可以很好地用作预测噬菌体-宿主相互作用的结构输入数据（图 3c）。

为了充分开发噬菌体疗法尚未开发的潜力，作者坚信需要一种跨学科的方法。除了基因组工程、合成生物学、结构引导设计和机器学习外，这还包括许多其他领域，例如药物配方和管理、药代动力学/动力学和免疫学。当与基于噬菌体的生物制剂生产和应用的非禁止性监管框架相结合时，这种综合方法描绘了一幅谨慎乐观的未来图景，即对多重耐药病原体有效的靶向噬菌体疗法。

参考文献

Lenneman, B. R., Fernbach, J., Loessner, M. J., Lu, T. K., & Kilcher, S. (2021). Enhancing phage therapy through synthetic biology and genome engineering. Current opinion in biotechnology, 68, 151–159. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2020.11.003