认识和命名：噬菌体疗法的噬菌体注释和命名法

噬菌体在环境中非常普遍，估计有¹⁰³¹噬菌体存在于存在细菌的所有环境中，包括土壤、水和人体。噬菌体最初被分离出来以靶向病原体，并在20世纪初被广泛用于治疗细菌感染。然而，在战后时代，抗生素的广谱活性取代了噬菌体，人们对它们的兴趣减弱了。在21世纪初，消除抗生素作用的抗生素耐药微生物的猖獗传播导致人们对使用噬菌体作为治疗剂重新产生兴趣。

噬菌体通常维持两种生活方式，温和的和有毒的，这取决于它们的遗传学和与细菌宿主的相互作用。温带噬菌体作为原噬菌体整合到细菌基因组中，建立长期的溶原关系。然而，整合的噬菌体（原噬菌体）可以在某些条件或触发因素下转变为裂解复制。温带噬菌体不适合用于噬菌体治疗，因为它们有可能将抗生素耐药性、毒力基因或致病性岛转移给其他细菌。此外，溶原性通常会导致重叠感染排斥，其中原噬菌体保护宿主免受其他密切相关噬菌体的感染。相反，毒力噬菌体使用裂解复制，诱导宿主细胞在感染后死亡。因此，专性裂解噬菌体是噬菌体治疗的首选，因为它们对赋予噬菌体抗性的敏感性降低。

首先根据噬菌斑形态筛选分离的噬菌体，旨在选择显示独特、清晰噬菌斑的裂解噬菌体。随后，对这些噬菌体进行测序以破译它们的基因组成并鉴定它们的基因。然而，65%的病毒基因在功能上未分配。为了解决这个问题，人们正在不断努力开发利用噬菌体特异性特征的新工具，促进蛋白质编码区的鉴定并推进其生物学功能的预测。这些注释在确定噬菌体相互作用、复制、进化动力学和宿主范围方面至关重要。准确的基因组注释还可以确保噬菌体不会将不需要的基因（例如抗菌素耐药基因和毒素）转移到新环境中。同时，这个过程允许选择具有提供抗菌和抗生物膜活性的解聚酶的基因组；抗成簇、规则间隔、短回文重复序列 （CRISPR）；以及帮助噬菌体克服细菌免疫系统的抗毒素基因。为了全面评估噬菌体的治疗潜力和多样性，我们将它们分类到合适的分类法中，以将噬菌体置于进化环境中。

在这篇文章中，作者概述了当前注释和命名噬菌体基因组的程序（图1）。概述了裂解噬菌体检测、基因组组装以及结构和功能注释，重点介绍了用于确定噬菌体对噬菌体治疗功效的关键蛋白质，并描述了已建立的噬菌体命名系统以及为符合标准化命名约定的噬菌体分配适当名称的程序。该资源允许精确的噬菌体鉴定、分类和理解，从而促进了基于噬菌体的疗法和生物技术的进步。            

图1 噬菌体分离和表征步骤概述

通常，我们收集富含细菌的环境样本，如土壤、水或污水，以分离噬菌体。我们首先富集和过滤以浓缩样品中的噬菌体。我们通过共培养细菌和环境样品来富集噬菌体，从而扩增环境噬菌体，从而提高噬菌斑数量。我们使用常用的双叠加法通过噬菌斑形成来观察、分离和纯化噬菌体，从而可以识别不同的形态。随后，我们挑选单个噬菌斑并培养它们，以从环境样品中分离不同的噬菌体种类。第二轮斑块使我们能够区分大（直径>3 mm）和小（直径1mm）斑块大小（图2）。其他形态学特征包括斑块周围的光晕，这表明核酸内切酶活性。有趣的是，裂解噬菌体的感染可以诱导原噬菌体，导致裂解和溶原噬菌体表型在单个双覆盖板中共存（图2）。为了鉴定裂解表型，基于此方法，如交叉划线和使用斑点和免疫测定技术检测自发噬菌体释放可以帮助识别温带表型。

图2 使用双叠加方法的不同斑块形态

经过连续几轮纯化后，我们通过连续稀释和滴定来计数噬菌体。我们通过透射电子显微镜和广泛的分类学分组来观察噬菌体。随后，我们大量培养噬菌体以提取DNA进行测序。尽管短读长测序技术更常用于组装噬菌体基因组，但人们对使用长读长测序的兴趣越来越大。最近的一项研究表明，长读长组装会产生更高质量、更完整的基因组组装;然而，它们需要用短读长测序进行抛光来纠正移码误差。我们的目标是在测序过程中实现25到100倍的覆盖度，因为较高的覆盖度通常会由于数据中过多的单核苷酸多态性而导致组装失败。测序后，第一步是通过质量控制修剪DNA序列，然后组装它们以恢复完整的噬菌体基因组。然后，我们评估噬菌体基因组的质量，因为低质量的噬菌体基因组会阻止准确的注释。为了评估基因组质量，使用MMseqs2将读数映射回组装的基因组，我们考虑成对末端之间的距离、读数的映射方向以及整个基因组的均匀读取覆盖率。我们使用 CheckV等工具进一步测试基因组完整性。尽管我们检查直接末端重复序列（DTR）以表明末端冗余，但组装过程通常会混淆基因组末端信号。此外，长读长组装与短读长组装相结合，可以解析噬菌体DTR。或者，我们的Phables算法探索组装图中的气泡，并突出显示和纠正终端冗余。组装后，我们使用包含基因组信息的计算方法来预测噬菌体的生活方式是有毒的还是有节制的。这些方法包括基于序列相似性的随机森林分类器、特定蛋白质结构域的存在以及使用这两种信息的混合方法.

第一步涉及识别开放阅读框 （ORF），它编码蛋白质和其他元件，如 tRNA、非编码 RNA、启动子和转座子。基因调用算法使用密码子使用和鸟嘌呤-胞嘧啶含量偏差、起始密码子、终止密码子、Shine-Delgarno 序列和在蛋白质翻译过程中与核糖体结合的短核苷酸序列来识别开放阅读框。噬菌体基因组的独特特性，如更高的编码能力、更短的基因间区域以及比细菌基因组更多的编码结构域序列之间的重叠，需要噬菌体特异性工具。 我们构建了 PHANOTATE来利用这些特性并改进噬菌体基因鉴定。此外，噬菌体使用多种技巧来扩展其遗传库，例如程序化核糖体移码，允许噬菌体通过切换到替代编码链来制造两种版本的蛋白质。与ORF一样，鉴定转移RNA（tRNA）基因结合了序列和结构特征。tRNAscanSE和ARAGORN等工具可在 ORF 调用开始之前识别 RNA 编码基因。一些噬菌体重新分配终止密码子来编码氨基酸，这是一种调节翻译和防止宿主细胞过早裂解的策略。此外，噬菌体基因组具有高度修饰和替代核苷酸，帮助噬菌体从细菌宿主中提取更多能量并保护其防御系统。长读长测序技术提供了另一个优势，单分子实时测序（PacBio SMRT）和Oxford Nanopore测序能够直接检测 DNA修饰。

在确定了蛋白质和RNA编码区域后，下一步是为每个基因分配生物学功能。尽管噬菌体的基因组比细菌小，但归类功能仍然具有挑战性，因为65% 的病毒蛋白序列缺乏已知的生物学功能。

噬菌体基因通常以以下几类功能之一编码蛋白质：首先，结构和包装蛋白包括衣壳、底板和尾纤维蛋白。这些蛋白质形成游离噬菌体的外衣壳。第二，噬菌体整合、切除和维持整合状态，包括重组和 DNA 结合蛋白。第三，DNA 复制蛋白，包括 DNA 聚合酶和单链结合蛋白。第四，辅助代谢基因，通常为细胞提供临时的代谢促进，以在噬菌体复制时增加能量产生。最后是功能未知的基因。

在噬菌体疗法的背景下，特定基因在决定噬菌体是否是噬菌体疗法的潜在候选者方面起着关键作用。例如，“整合酶”注释的基因不是首选，因为它们是温和生活方式的标志物。虽然特定的基因功能可能赋予噬菌体治疗优势，但这包括噬菌体编码的解聚酶基因，这些基因会降解细菌表面的特定成分，包括细胞外多糖和生物膜基质。解聚酶活性可以表现为斑块周围的光晕（图2），这种基因活性使细菌更容易受到宿主感染，从而改善了进入细菌表面的机会并减少了抗生素依赖。注释管道可能会将这些基因标记为“解聚酶”、“宿主相互作用蛋白”、“胶囊降解酶”、“生物膜基质降解酶”或类似标记。

大多数生物有机体都使用二项式命名法和标准分类层次结构来命名。国际病毒分类委员会 （ICTV） 是病毒分类的权威委员会。它将分类分为界和种之间的15个分类等级。ICTV 批准病毒命名法，细菌和古细菌病毒小组委员会 （BAVS）负责噬菌体命名法。批准新噬菌体的主要要求是将完整的基因组序列存入3个国际核苷酸序列数据库协作 （INSDC） 成员数据库中的1个中。截至2022年，ICTV 已批准 6个领域、10个界、17个门、2个亚门、40个类、72个目、8个亚目、264个科、182个亚科、2818个属、84个亚属和 11273个种。

命名噬菌体的第一步是为分离株发明一个新颖的名称。噬菌体的处方有几种指南（例如，SEA-PHAGES计划有一套规则，https://phagesdb.org/namerules/，ICTV BAVS的成员发布了一份非正式的名称选择指南）。指南相似：不要使用现有的噬菌体名称或与当前名称相似的名称，保持名称简短（大约5到15个字符），并且不要以数字开头。下一步是确定它与已知噬菌体序列相比的新颖性。我们通常会将噬菌体的基因组序列与现有数据库中的噬菌体基因组进行比较。Millard 实验室维护并定期更新完整噬菌体基因组 （https://millardlab.org/） 列表。ICTV 指南表明，新物种在核苷酸水平上与现有物种的差异超过 5%。相比之下，新属在核苷酸水平上与现有属的差异超过 50%。独特的特征区分未知的分类组，包括基因组长度、编码序列数量和标记基因（如门静脉蛋白、大终止酶和重要衣壳基因）的系统发育聚集。高级分类（例如，亚家族或家族）仍然需要电子显微镜照片，以根据噬菌体的形态类型将噬菌体分类为适当的组。

噬菌体注释和命名对于精确鉴定和表征噬菌体至关重要。它们还促进了研究数据的交流和共享。正确的命名和注释可确保命名和描述噬菌体的一致性和清晰度，这对于了解其生物学特性、宿主范围和基因组成至关重要。它还允许比较和整合来自不同研究的数据，从而促进噬菌体生物学和生物技术的进步。仔细的噬菌体注释是噬菌体治疗的先决条件。

参考文献

Grigson, S. R., Giles, S. K., Edwards, R. A., & Papudeshi, B. (2023). Knowing and Naming: Phage Annotation and Nomenclature for Phage Therapy. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 77(Suppl 5), S352–S359. https://doi.org/10.1093/cid/ciad539