耐药细菌克星”nd-SlipChip：2小时精准锁定治疗方案

nd-SlipChip的工作原理

此项研究展示了一种新型nd-SlipChip（nano-dilution SlipChip），它能够通过简单的滑动操作生成一系列具有2倍连续稀释度的抗生素液滴。

这种微流控装置能够实现快速抗菌素敏感性测试（antimicrobial susceptibility testing, AST），在短短2小时内即可获得AST结果。nd-SlipChip由两层组成，每层都具有专门设计用于液滴生成和操控的微结构。上层板由一排八行的平行微孔组成，用于液滴生成，以及五个储液室，用于加载高浓度的抗生素和细菌。下层板包含流体加载通道和一行稀释微孔。每个微孔的半径为450微米，深度为50微米，体积为30纳升。首先，组装nd-SlipChip，并将微孔与加载通道连接起来。接下来，将细菌引入微流控装置中，并通过简单的滑动程序生成包含细菌的微滴阵列。同时，断开下层加载通道与上层微孔的连接，并连接上层储液室的加载通道。然后将细菌和高浓度抗生素的混合物加载到储液室中。通过从左到右逐渐滑动，形成了一个包含细菌和抗生素的、具有1:2稀释比的连续稀释纳升级阵列，用于AST（图1A-B）。研究者还使用荧光染料进一步表征了芯片的液滴生成均匀性和2倍梯度稀释能力，确认了其良好的均匀性和稀释准确性，符合AST的标准（图1C-F）。

图1：nd-SlipChip操作原理的示意图^[1]

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在nd-SlipChip上的AST结果

为了评估这种nd-SlipChip在进行快速抗菌素敏感性测试方面的可行性和有效性，研究者选择了标准菌株大肠杆菌ATCC 25922，并使用了亚胺培南和替加环素进行测试。研究者监测并记录了在3小时期间液滴中细菌的生长情况和形态变化。通过分析0小时和2小时时间点的结果，研究者能够获得AST结果以及抗生素的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）。亚胺培南和替加环素的MIC分别为0.5 μg/mL和0.125 μg/mL，这两个值均位于美国临床和实验室标准协会（Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI）报告的最小抑菌浓度质量控制（MIC QC）范围内（图2A和B，图S2）。这一结果表明，nd-SlipChip能够进行快速AST。因此，在后续实验中仅在0小时和2小时时间点采集显微图像。对于革兰氏阳性菌，研究者选择了金黄色葡萄球菌ATCC 25923进行测试，对抗菌剂呋喃妥因，并分析了细菌形态变化以确定MIC（图2C和D）。

图2：nd-SlipChip上大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的AST结果^[1]

VITEK 2、BMD和nd-SlipChip方法获得的临床分离株的AST谱和MIC值

为了进一步评估nd-SlipChip在抗菌素敏感性测试方面的能力，研究者测试了18种临床分离的多重耐药革兰氏阴性细菌菌株，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌。选择了临床上常用的抗生素，如头孢他啶、亚胺培南、左氧氟沙星和替加环素。将nd-SlipChip获得的AST结果与VITEK 2系统和微量肉汤稀释法（broth microdilution, BMD）的结果进行了系统比较。nd-SlipChip的AST结果与BMD方法的结果完全一致，且比VITEK 2的结果更准确。

除了革兰氏阴性临床分离株外，nd-SlipChip还可应用于革兰氏阳性细菌的AST。测试了6株金黄色葡萄球菌临床分离株对四种常用抗生素（包括氧西林、利福平、呋喃妥因和左氧氟沙星）的敏感性。与传统BMD方法确定的AST结果相比，nd-SlipChip达到了97.9%（94/96）的类别一致性，有2.1%（2/96）的微小误差，无主要误差和非常严重误差。这些结果符合美国临床和实验室标准协会的标准（类别一致性≥90.0%，微小误差≤10.0%，主要误差≤3.0%，非常严重误差≤1.5%）

最小抑菌浓度是衡量抗生素活性的参考标准。确定MIC的金标准测定方法是BMD和E-test。研究者将nd-SlipChip获得的MIC值与BMD方法获得的MIC值进行了比较。大多数MIC值与BMD方法的值匹配良好。与BMD方法得出的MIC结果相比，84个nd-MIC值相同或有一倍差异，基本一致性（essential agreement, EA）为87.5%（84/96）。7个nd-MIC结果有两倍差异，4个nd-MIC结果有三倍差异，1个结果有超过三倍差异。

基于nd-SlipChip和BMD测定抗生素联用效果

针对耐药细菌感染，结合使用抗生素与非抗生素活性增强化合物成为了一种有效的治疗策略。这种联合治疗不仅拓宽了抗生素的抗菌谱，还减少了所需剂量及相关的不良反应，同时有助于缓解抗生素耐药性的问题。在特定的治疗选项中，β-内酰胺抗生素与β-内酰胺酶抑制剂的结合被广泛应用于治疗产超广谱β-内酰胺酶的病原体。研究者选择了头孢他啶（16 μg/mL）与其他抗生素的连续两倍稀释液组合，以评估这些抗生素的联合效果。nd-SlipChip获得的结果与BMD方法的结果高度一致，但nd-SlipChip在2小时内即可提供结果，这显著快于BMD方法。

在nd-SlipChip和96孔板上评估噬菌体裂解活性

针对严重的抗生素耐药感染，当缺乏有效的抗生素时，噬菌体疗法可能成为最后的治疗手段。本此项研究中，研究者针对一种碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）分离株D380，在抗生素联合治疗无效的情况下，尝试了噬菌体疗法。

研究者从包含69种不同鲍曼不动杆菌特异性噬菌体的噬菌体库中，筛选出能够裂解鲍曼不动杆菌D380的噬菌体，并发现六种噬菌体能够产生清晰的噬菌斑。随后，研究者利用新型nd-SlipChip技术评估了这些噬菌体的裂解活性，该技术能够在1小时内完成评估，远快于传统的双层琼脂平板法。

此外，研究者还研究了细菌与噬菌体之间的对抗性共进化，这是驱动和维持微生物多样性的关键因素。nd-SlipChip技术不仅能够快速进行抗生素敏感性测试，还能在2小时内评估抗生素组合和噬菌体裂解活性，对于难治性多重耐药感染的治疗具有重要意义。该技术通过简单的滑动操作生成四种两倍稀释的抗生素或噬菌体含液滴，无需手动生成微稀释液或使用大型机器人分配系统。通过显微镜监测细菌生长曲线，研究者可以对革兰氏阴性和革兰氏阳性临床分离株进行快速AST，并在2小时内获得高准确度结果。

结论

这项研究介绍了一种新型微流控装置nd-SlipChip系统，它能快速评估抗生素敏感性、药物组合及噬菌体裂解活性。该系统在24种临床分离株上的测试显示高度准确性。对于多重耐药细菌感染，nd-SlipChip能有效筛选出抗生素组合或噬菌体疗法，为精准治疗细菌感染提供快速合理的治疗方案。。

参考文献：

1. Wang Q, Li X, Ren Y, Hu Q, Xu L, Chen W, Liu J, Wu N, Tao M, Sun J, Xu Y, Shen F. Rapid and precise treatment selection for antimicrobial-resistant infection enabled by a nano-dilution SlipChip. Biosens Bioelectron. 2024 Dec 24;271:117084. doi: 10.1016/j.bios.2024.117084. Epub ahead of print. PMID: 39731822.