针对肺炎克雷伯菌的可调荚膜趋向性噬菌体的数据驱动工程

1. 噬菌体库的构建与分类

研究者从医院废水和生活污水中分离出114种具有非冗余序列的双链DNA噬菌体，这些噬菌体的基因组大小从27814到350174 bp不等，包含48到634个预测编码序列，且未发现抗生素抗性基因或毒力因子。通过与NCBI数据库中的121种肺炎克雷伯菌噬菌体进行比较，构建了蛋白距离树，发现这些噬菌体涵盖了7个科、10个属，并且61种噬菌体与已知基因组的平均核苷酸同一性（ANI）低于95%，表明它们可能是新物种。此外，4种噬菌体可能属于3个新科。

2. 大规模噬菌体-宿主相互作用分析

研究者构建了一个包含238种肺炎克雷伯菌的宿主库，这些菌株涵盖了105种序列型（STs）和55种常见的荚膜（KL）类型。通过斑点测试评估噬菌体库对这些菌株的裂解能力，发现223种菌株（93.7%）至少被一种噬菌体裂解。通过层次聚类分析，噬菌体-宿主相互作用被划分为5个模块（M1-M5），其中M1具有广谱裂解能力，而M2-M5具有特定KL类型的高特异性。此外，还有40种噬菌体未按宿主KL类型聚集，被归为M6模块。

3. 噬菌体裂解模式的多样性

尽管噬菌体在同属内表现出相似的系统发育关系（ANI > 70%），但它们的裂解模式却表现出多样性。例如，Webervirus和Drulisvirus属的噬菌体可以裂解M1、M2、M3、M5和M6模块，而Przondovirus属的噬菌体则包含所有已识别的裂解模块。这表明噬菌体的裂解模式与其系统发育关系并无明显相关性。

4. 尾蛋白簇与裂解模块的相关性

通过比较Webervirus、Jedunavirus、Przondovirus和Drulisvirus属噬菌体的形态发生蛋白基因簇，发现尾蛋白基因与裂解模块之间存在强相关性。基于55种尾蛋白序列构建的系统发育树显示，这些蛋白形成了6个单系类群（Cluster I-VI），分别对应不同的裂解模块。例如，Cluster I和II的尾蛋白与M2模块相关，裂解KL1菌株；Cluster III和IV与M3模块相关，裂解KL2菌株；Cluster V与M4模块相关，裂解KL64菌株；Cluster VI与M5模块相关，裂解KL57菌株。

5. 受体结合蛋白（RBPs）的功能验证

研究者通过比较野生型菌株和无荚膜突变株的感染能力，验证了这些尾蛋白作为RBPs的功能。结果显示，特定RBPs的噬菌体只能在野生型菌株上形成噬菌斑，而不能在无荚膜突变株上形成，表明RBPs与细菌荚膜多糖（CPS）结合。此外，通过表达和纯化这些RBPs，并在不同KL类型菌株上进行斑点测试，进一步证实了RBPs对特定KL类型多糖的降解能力。

6. 多价RBPs的发现

研究中还发现了一些具有多价裂解能力的RBPs，这些RBPs来自M1和M6模块的噬菌体，能够裂解多种KL类型。通过序列比对，发现这些多价RBPs与专性RBPs之间存在高度序列同源性（90%-99.47%），但存在少量氨基酸替换，这些替换可能决定了RBPs的特异性和功能差异。

7. 工程噬菌体的构建与功能验证

基于新发现的RBPs，研究者通过替换噬菌体的RBPs来改变其宿主特异性。以噬菌体RCIP0035为例，通过将RBPIII-RCIP0035基因替换为RBPVIRCIP0082基因，成功构建了重组噬菌体RCIP0035∆rbpIII::rbp0082，其宿主特异性从KL2转变为KL57。此外，通过将RBPIII-RCIP0035基因替换为RBPIII-RCIP0046或RBPI-RCIP0104基因，构建的重组噬菌体RCIP0035∆rbpIII::rbp0046和RCIP0035∆rbpIII::rbp0104均表现出扩展的宿主范围，能够裂解KL1、KL2和KL57类型的菌株。

8. 工程噬菌体的潜在应用

研究结果表明，通过替换RBPs，可以精确地改变噬菌体的宿主特异性，使其能够靶向特定的肺炎克雷伯菌荚膜类型。这种方法不仅简化了噬菌体治疗的复杂性，还为开发具有明确宿主范围的合成噬菌体库提供了可能，有助于推动噬菌体治疗的标准化和监管简化。

综上所述，本研究通过大规模分析噬菌体与肺炎克雷伯菌的相互作用，成功鉴定出决定宿主特异性的RBPs，并利用这些RBPs对噬菌体进行工程改造，实现了宿主特异性的调整和扩展。这一成果为噬菌体治疗的精准化和标准化提供了重要的理论和技术支持。

文章来源：10.1002/advs.202309972