双噬菌体扩增介导的多重检测策略，用于同时检测肠道沙门氏菌 和金黄色葡萄球菌

多重细菌检测对于监测关注多种病原体种类的各种病原体情况至关重要。基于双噬菌体扩增的策略 （PAA） 与多重检测技术相结合，可在单管中同时检测细菌。该测定对两种常见的食源性病原体进行标准化：肠道沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。在目标细菌存在的情况下，噬菌体可以特异性识别活细胞并在细胞内自我复制以产生更多的后代噬菌体。热裂解 10 min 后，用多重检测策略分析含有子代噬菌体 DNA 的产物。多重检测策略的特异性与 PAA 检测的高灵敏度相结合，使该检测对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的同时定量具有快速、特异性和灵敏性。定义了 PAA、单一和多重 qPCR 的优化参数，并在规定的实验条件和实际样品中验证了单一和多重反应的分析灵敏度、特异性和稳定性。结果显示线性范围很宽 （^10-108CFU/mL），所有测试细菌的检出限为 10 CFU/mL。此外，总检测时间可以减少到不超过 4 小时。该分析方法已成功应用于实际食品样品，结果与传统平板计数方法相当。由于操作快速简单、灵敏度低、成本低、特异性高以及区分活细菌的能力，所提出的基于 PAA 的多重 qPCR 测定为同时检测活细菌提供了一种有效且有前途的策略。

作为概念验证，PAA 是基于噬菌体开发的，以裂解生命周期的形式开发，以特异性识别和裂解其宿主细菌。裂解噬菌体在注射噬菌体基因组后，通过附着细菌表面对受体具有特异性的尾蛋白感染宿主细菌，噬菌体在裂解和释放后代噬菌体之前在细菌细胞内复制（图 1）。过量的噬菌体被杀病毒剂 FAS 去除。噬菌体高度多样化，即使在环境中的极端条件下也能发现。即使是密切相关的噬菌体也可以靶向宿主细菌上的不同受体结合蛋白。一些识别革兰氏阴性菌表面的脂多糖和其他结构蛋白，而另一些识别革兰氏阳性菌的表面，该细菌由厚的肽聚糖层和脂磷壁酸组成。目前，扩大噬菌体宿主范围的主要策略是使用多噬菌体混合物。推测混合不同的噬菌体可能具有同时检测不同细菌的潜力。此外，在噬菌体扩增后检测其后代噬菌体是一种很有前途的扩增策略，而不是直接检测食源性病原体，并且可以进一步提高检测活菌的灵敏度。因此，该检测是基于多重 qPCR 开发的，以靶向后代噬菌体。根据假设，研究工作以沙门氏菌和葡萄球菌为模型进行了三个部分的测试。首先，基于两种新型噬菌体沙门氏菌噬菌体 SEP37 和葡萄球菌噬菌体 LSA2311 开发和优化 PAA 。其次，设计了用不同荧光团标记的引物和 TaqMan 探针来检测特异性靶噬菌体基因，确保高特异性。基于 PAA 的 qPCR 分别用于沙门氏菌和葡萄球菌的单一病原体检测。最后，双 PAA 与多重 qPCR 联用，同时检测沙门氏菌和葡萄球菌。

图1 用于同时和多重检测食源性病原体的 PAA-多重 qPCR 示意图。PAA 用于噬菌体扩增 （A） 和多重 qPCR 检测子代噬菌体 DNA （B） 的机制。

参考文献：Dual phage amplification-mediated multiplex detection strategies for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Staphylococcus aureus