一种用于比色生物传感器系统设计的新型铜（II）结合肽

　　文章应用噬菌体展示技术，通过最小化与其他竞争金属离子(包括Ni(II)、Zn(II)、Co(II)、Al(III)和Fe(III)的潜在结合，来识别仅针对Cu(II)离子的高度特异性七肽基序。随机选择15个噬菌体噬菌斑并测序。选择出现频率最高且Cu(II)亲和力最强的Cu-5肽(HGFANVA)进行进一步的Cu(II)检测和去除测试。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)证实了工程病毒具有很强的Cu(II)结合潜力。在C端用三个半胱氨酸单元合成了Cu-5肽，并根据Cu(II)离子处理后AuNPs的聚集行为开发了AuNP肽生物传感器系统。基于AuNP的Cu(II)传感器对Cu(II)具有选择性，LOD为91.15nM(约5.8×10−3毫克/升;3σ/k，n=5.R2=0.992)，远低于WHO公认的1.3mg/L指南。本研究提供了一种跨学科的方法，将短肽作为生物传感器研究的识别单元，该方法用户友好、不笨重且具有成本效益。

　　图1 使用基于琼脂糖的 NTA 微珠进行的噬菌体生物淘选步骤。

　　图2 在完成所有阴性/阳性筛选后，对最终的 Cu(II) 结合噬菌体进行金属离子结合亲和力测试。ELISA 分析 (A) 使用金属离子涂层磁性 NTA 珠进行，随后通过 SEM 成像 (B) 进行研究。SEM 分析在 10 kV 高真空下进行。EDX 光谱是在红色框内采集的。

　　图3 通过 ELISA 分析对 Cu-5 和 Cu-14 噬菌体进行金属离子结合选择性测试。

　　图4 吸附 1 mM Cu(II) 后，记录靶向 Cu-5 肽 (HGHAVA) 的 AP-MALDI-MS 全扫描(作为案例研究)。插图显示了对应于 肽-Cu(II) 簇的放大质谱。注意：由于用 CHCA 稀释，电流光谱对应于 500 μM 的 Cu(II);激光通量 45%。

　　图5 胶体考马斯染色后不含和含有 Cu-5 病毒的细胞孔珠的数码相机 (A) 和光学显微镜 (B) 图像。(C) Cu-5 噬菌体固定前后细胞孔珠的 Zeta 电位分析。(D) 用不同浓度的 Cu(II) 溶液处理的含/不含 Cu-5 噬菌体的细胞孔珠的吸附效率。通过 ICP-MS 定量 Cu(II) 离子的起始和结束浓度。

　　图6 AuNP 与 Cu-5_3Cys 肽的相互作用以及 Cu(II) 处理后的预期聚集行为 (A)。将 20 nm PBS 稳定的 AuNP 与不同浓度的肽溶液一起孵育，并通过紫外-可见吸收光谱分析 (B) 进行监测。插图显示了反应混合物的相应数码相机图像。

　　图7 (A) 用不同浓度的 Cu(II)(0、0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8 和 10 μM)处理的 Cu-5_3Cys (HGFANVACCC) 肽功能化的 20 nm AuNP 的紫外-可见吸收光谱。插图显示了 Cu(II) 浓度不同时反应混合物的颜色变化。(B) 比色测定系统在 700 和 523 nm 处的吸光度比 (Abs700/Abs523) 与 Cu(II) 浓度的响应。(C) 在各种 Cu(II) 浓度(0、0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8 和 10 μM)下，用不含任何 Cys 单元的 Cu-5 (HGFANVA) 肽处理的 AuNP 的紫外-可见吸收光谱。(D) 使用各种干扰金属离子 (Al(III)、Co(II)、Fe(III)、Ni(II) 和 Zn(II))在 5 μM 和 2 μM、3 μM 和 5 μM 的 Cu(II) 作为对照的情况下，设计的比色系统的选择性测试。插图是样本的数码相机图像。

　　参考文献：A novel copper (II) binding peptide for a colorimetric biosensor system design.