CRISPRi-ART：噬菌体功能基因组研究的革命性工具

CRISPRi-ART技术设计原理

研究通过构建一个单核苷酸分辨率的crRNA库，对大肠杆菌编码必需基因的转录本进行靶向，从而识别出易受翻译抑制影响的区域。实验结果显示，当dCas13d靶向必需基因的核糖体结合位点（RBS）时，大肠杆菌的生长受到抑制，而靶向非必需基因则对生长无影响。通过对靶向代表性必需基因转录本的引导RNA丰度的对数变化进行测量。

1.       设计crRNA库

首先，需要设计一个单核苷酸分辨率的crRNA库，这些crRNA能够靶向大肠杆菌或其他生物体的转录本，特别是编码必需基因的转录本。crRNA的设计要确保它们能够特异性地结合到目标mRNA上，并且覆盖整个转录本，以便全面评估不同区域对翻译的敏感性。

2.       构建表达系统

将dCas13d酶和crRNA库导入到目标生物体中。dCas13d酶的表达受到可诱导启动子的控制，以便在需要时启动其表达。crRNA库的表达也受到另一个可诱导启动子的控制，以确保在诱导条件下能够产生足够的crRNA来靶向目标mRNA。

3.       诱导表达并筛选

在适当的条件下诱导dCas13d酶和crRNA库的表达。由于dCas13d酶的结合会导致目标蛋白质表达水平的降低，因此可以通过观察生物体的生长情况或其他表型变化来评估不同crRNA的效果。通过高通量测序等技术手段，可以测量crRNA丰度的变化，从而确定哪些crRNA能够有效地靶向目标mRNA并抑制其翻译。

4.       数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，识别出哪些crRNA导致了显著的生长抑制或适应性缺陷。通过比较不同crRNA的靶向位置和效果，可以确定dCas13d酶结合mRNA的敏感区域和关键位点。

CRISPRi ART能够靶向破坏噬菌体感染

为了评估CRISPRi-ART是否能够通过核糖体结合位点靶向来区分噬菌体基因的必需性，作者将噬菌体T4应用于表达可诱导dCas13d和组成型crRNA的大肠杆菌。作者假设，靶向非必需噬菌体基因不会导致感染力丧失，而靶向必需噬菌体基因则会导致感染力降低。作者发现，与靶向非必需基因的crRNA无抑制效果相比，靶向必需T4基因的crRNA将噬斑形成效率（EOP）降低了102–104倍。抑制仅在dCas13d诱导时发生，这表明蛋白质敲低并非由于dCas13d表达的泄漏。为了比较CRISPRi-ART与先前建立的双链DNA靶向CRISPRi工具的性能，作者评估了dLbCas12a和dSpyCas9介导的噬菌体抑制效率。测定结果显示，CRISPRi-ART还避免了极性效应，从而能够更准确地分配噬菌体基因的必需性。

结论

CRISPRi-ART技术在噬菌体功能基因组学研究中具有广泛的应用前景。通过系统地识别mRNA转录本中易受dCas13d介导的翻译抑制影响的区域，研究人员可以更深入地了解噬菌体基因的功能和适应性。总之，CRISPRi-ART技术是一种强大的基因干扰工具，它利用dCas13d酶的特性来选择性干扰蛋白质翻译，并在转录组范围内测量噬菌体基因的适应性。通过该技术的应用，我们可以更深入地了解噬菌体基因的功能和适应性。此外，CRISPRi-ART技术还可以用于筛选和鉴定新的抗病毒药物靶点，为噬菌体感染的治疗提供新的策略和方法。

参考文献：

1.  Adler BA, Al-Shimary MJ, Patel JR, Armbruster EG, Colognori D, Charles EJ, Miller KV, Lahiri A, Cui ML, Oromí-Bosch A, Voelker A, Trinidad M, Lee J, Beurnier S, Boger R, Nomburg J, Barrangou R, Mutalik VK, Schoeniger JS, Pogliano JA, Savage DF, Doudna JA, Cress BF. CRISPRi-ART enables functional genomics of diverse bacteriophages using RNA-binding dCas13d. Nat Microbiol. 2025 Feb 26. doi: 10.1038/s41564-025-01935-7. Epub ahead of print. PMID: 40011704.