几个世纪以来，癌症一直是一种顽固的疾病，多年来，已经开发了许多治疗方式（图1）。从历史上看，手术切除肿瘤是癌症患者最早可用的治疗选择之一，但其疗效有限。半个多世纪以来，由于人们对癌症的生物学知之甚少，以及抗生素、化疗和放疗的出现，用现在被广泛称为免疫疗法治疗癌症的早期尝试一直被忽视。后两种方法极大地影响了癌症领域，几十年来一直是肿瘤学的支柱。不幸的是，化疗和放疗对健康组织和器官的不良影响会严重影响患者的预后。

随着时间的推移，靶向免疫治疗方法的发展，特别是那些基于抗体和抗体-药物偶联物（ADC）的方法，极大地扩展了抗癌工具的武器库，提供了疗效增强和毒性相对较低的优势。其他值得注意的靶向抗癌免疫疗法类型包括使用检查点抑制剂、表达嵌合抗原受体（CAR）或重组TCR的T或NK细胞的过继转移、溶瘤病毒疗法、基于树突状细胞和mRNA的疫苗，前两种方法同样严重依赖于识别能够靶向肿瘤相关抗原的抗体（图2）。

图1 主要癌症治疗方法的首次记录报告或批准的时间表

图2 靶向癌症免疫疗法。

已经开发了三种主要技术来识别具有治疗活性的抗体。这些包括杂交瘤平台、单个人或小鼠B细胞的分离以及噬菌体/酵母展示（图3）。值得注意的是，2018年，诺贝尔化学奖的一半授予了George P. Smith教授和Gregory P. Winter 爵士，以表彰他们在噬菌体展示技术开发方面的开创性工作。该平台为鉴定高度特异性的治疗性抗体提供了强大的框架，真正彻底改变了蛋白质/抗体工程和药物发现领域。尽管有这些技术进步和数十年的研究，但确定新的癌症靶向抗体和新靶点以开发有效且毒性较小的治疗方式仍然是优先事项。

图3 获得单克隆抗体的方法

迄今为止，已经构建了噬菌体展示文库，并针对数千种蛋白质靶标进行了筛选，包括来自感染因子、癌细胞以及参与自身免疫的蛋白质靶标。这项技术已被大量用于药物发现和生物仿制药的开发。因此，它仍然是开发新的和更有效的疗法的宝贵工具，噬菌体展示的应用范围可能会扩大。然而，与所有技术一样，噬菌体展示也有其自身的优势和劣势。

使用噬菌体作为外源肽和蛋白质展示系统的概念最初是由George P. Smith教授于1985年提出的，使用丝状噬菌体f1作为模型。随后，很快出现了描述这种方法应用于组合抗体文库筛选的开创性论文。与上述Fd和f1一起，噬菌体M13属于一组F特异性丝状噬菌体（Ff）。这些噬菌体在细菌宿主（如大肠杆菌）中繁殖而不杀死它们（即，它们是非裂解的），并且具有阳性环状单链 DNA 基因组，在核苷酸序列水平上约为 98.5% 相同。基于 M13 的平台是噬菌体展示中最常用的平台。M13 生物学、生命周期和结构的概述如下。M13 衣壳由 5 种蛋白质组成：pIII、pVI、pVII、pIX（小外壳蛋白，∼5 拷贝/病毒颗粒）和 pVIII（主要外壳蛋白，∼2700 拷贝/病毒颗粒）（图4）。M13噬菌体通过其pIII和pVI蛋白附着在大肠杆菌的菌毛上，并将DNA引入宿主。细菌复制机制合成互补（-）链，从而形成双链 DNA 复制形式。这种形式用作合成病毒 RNA 然后进行翻译以及基因组复制的模板，最终导致新噬菌体颗粒的组装。组装完成后，噬菌体后代离开细菌宿主。

图4 M13噬菌体的结构及其基因组

除了流行的M13噬菌体外，其他噬菌体如T4、T7、λ-phage和RNA Coliphage Qβ也已成功用于噬菌体展示平台。T4噬菌体的基因组由一个线性双链DNA组成，大小约为170 kb，包含289个开放阅读框。T4相对于其他噬菌体（包括M13）的主要优势之一是它可以呈现大蛋白以供展示，因为它能够耐受大插入并且噬菌体本身体积大。同样重要的是T4是一种裂解噬菌体，具有明显更广泛的宿主嗜性。因此，由于融合蛋白通过细菌细胞壁的复杂分泌过程和伴随的构象变化而不适合在M13上展示的蛋白质，可以很容易地被T4展示。第一个基于T4的噬菌体展示依赖于与次要T4纤维蛋白纤维蛋白（gpwac，6个拷贝/病毒粒子）的融合，而后来的T4展示系统使用两种可支配的衣壳蛋白SOC（155个拷贝/病毒粒子）和HOC（810个拷贝/病毒粒子）作为噬菌体头部的融合伴侣。值得注意的是，该系统提供了同时显示与SOC和HOC的N端或C端融合的两种目标蛋白的灵活性。

治疗性抗癌抗体最常见的形式是其天然形式，称为免疫球蛋白G（IgG），它由两条重链和两条轻链组成，由二硫键连接在一起（图5a）。每条抗体链都包含一个可变区和一个恒定区。轻链和重链的可变区组合形成抗体旁位，负责与特定抗原结合。抗体重链的恒定区决定了其生物活性，例如吸引介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的免疫细胞的能力，参与补体依赖性细胞毒性（CDC），经历内化/再循环、转胞吞作用等。由于它们的尺寸大，以及准确的二硫键形成和翻译后修饰的必要性，全长IgG不能显示在噬菌体表面。相反，更紧凑的抗体片段，如scFv、Fab、sdAb、纳米抗体和双抗体已成功用于噬菌体展示，其中 scFv、纳米抗体和 Fab 是最常见的形式（图5b-e）。尽管这些小抗体片段通常表现出良好的稳定性，但由于它们的清除速度快、无法募集效应细胞和低亲和力，因此它们的临床应用有限，这反过来可能需要额外的工程工作。虽然将scFv转换为其他形式（如全长 IgG）可能会导致特异性丧失或亲和力降低，但对于Fab片段来说，这并不重要。值得注意的是，Fab在噬菌体表面的表达水平通常低于scFvs的表达水平，这可能会限制基于Fab的显示平台的效用，因为这些平台需要均匀的高文库成员表达水平。

图5 常见的抗体形式

噬菌体展示技术已被证明是发现和开发抗癌治疗性抗体的宝贵工具。噬菌体展示能够生产和筛选大型且高度多样化的抗体库，使其成为鉴定对癌症相关靶标具有高特异性和亲和力的抗体的坚实平台。这些抗体在临床前和临床研究中显示出前景，有几种药物已获批用于癌症患者。预计未来噬菌体展示技术在治疗性抗体开发中的应用将继续增长，尤其是随着新展示平台的出现和抗体工程的进步。随着不断努力优化抗体设计和递送，噬菌体展示衍生的治疗性抗体具有巨大的潜力，可以对癌症治疗和患者预后产生重大影响。

参考文献：

Istomina, P. V., Gorchakov, A. A., Paoin, C., & Yamabhai, M. (2024). Phage display for discovery of anticancer antibodies. New biotechnology, 83, 205–218. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2024.08.506