噬菌体和噬菌体递送的 CRISPR-Cas 系统作为抗菌疗法

噬菌体（噬菌体）是一类能够感染细菌的病毒。噬菌体于1915年首次被记录，并于1917年被命名为噬菌体。已经尝试使用噬菌体治疗传染病，但由于使用困难、疗效差和抗生素的使用增加，在1940年代之后普遍被放弃。然而，随着抗菌素耐药性的出现，噬菌体疗法已成为对抗这些“超级细菌”的一种有前途的治疗选择。在过去几年中，已经发表了许多关于噬菌体疗法的成功案例和临床试验，包括：常规单噬细胞疗法的研究;噬菌体衍生的酶;噬菌体、抗生素和免疫反应的协同作用；和生物工程噬菌体。然而，缺乏证明噬菌体疗法安全性和有效性的随机对照试验 （RCT），以及生产和营销授权等一些监管问题，对其实际应用构成了障碍。

除了传统的噬菌体疗法外，“成簇的规则间隔短回文重复序列”和“CRISPR相关蛋白”，缩写为CRISPR-Cas系统，是原核生物的适应性免疫系统[6]，已被用作基因组编辑工具和多重耐药（MDR）细菌的新疗法。然而，用于靶向微生物的CRISPR-Cas系统的设计和执行仍然是一个重大挑战。提供CRISPR-Cas系统的一种有效方法是通过基于噬菌体的工程载体，这也可以被认为是噬菌体衍生的抗菌疗法。在本文中，我们回顾了噬菌体疗法和CRISPR-Cas 系统作为抗菌治疗的最新进展，以及噬菌体疗法的 RCT。此外，我们在示意图中展示了CRISPR-Cas系统抗菌剂的机制，并总结了噬菌体递送的CRISPR-Cas 系统的当前数据。

在通过CRISPR-Cas9进行基因编辑时，crRNA [与单向导RNA（sgRNA）相同]和Cas9蛋白需要在靶细胞中具有活性。靶DNA被sgRNA识别，并与切割复合物结合。然后，发生双链断裂，随后通过 DNA 修复机制进行修复。

CRISPR-Cas系统可以递送到靶细胞中四种主要的材料组合：（A）编码Cas9蛋白和sgRNA的质粒或噬菌粒；（B）Cas9 mRNA和sgRNA [24];（C）Cas9蛋白和sgRNA [25];（D）单独的sgRNA（图1）。前三种材料组合利用外源性CRISPR核酸酶，而最后一种使用sgRNA激活内源性CRISPR-Cas系统以消除靶细胞，这些靶细胞由多种细菌编码，包括金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和肺炎克雷伯菌。相似但不完全相同的递送组分往往实现相同的目标，即基因编辑。

图1 抗菌CRISPR-Cas系统递送和基因组编辑的不同途径和材料

除了不同的递送材料外，还报道了将CRISPR-Cas系统递送到靶细胞中的不同方法，例如病毒和非病毒递送。非病毒递送包括使用纳米颗粒、电穿孔、流体动力学递送和共轭递送。病毒递送包括使用逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒以及最近的噬菌体递送。

MDR细菌的全球出现代表了日益增长的公共卫生问题。由于新出现的抗生素耐药性的速度超过了新抗生素的开发速度，因此已经开发了对抗 MDR 病原体的替代策略，包括噬菌体疗法和 CRISPR-Cas9 系统。CRISPR-Cas系统可以以不同的内容和多种方式递送到靶细胞（图1）。使用 CRISPR-Cas系统进行基因组编辑可以敲除细菌中的特定靶基因。这些切割靶点包括细菌毒力因子、抗生素耐药基因以及细菌物种特有的基因。靶基因切割后，可能会出现几种导致细胞死亡的机制：（i）无法修复的基因组损伤;（ii）噬菌体裂解复制过程中的细胞裂解;（iii）对伴随的抗菌剂重新敏感（图1）。

CRISPR-Cas 递送到靶细胞有多种方法。然而，它作为靶向抗菌素耐药细菌细胞的递送是有限的。在上述各种递送系统中，只有噬菌体、纳米颗粒和偶联递送被用于递送 CRISPR-Cas 系统以对抗 MDR 细菌。Kang等人使用聚合物衍生的CRISPR纳米复合物靶向mecA（一种在耐甲氧西林细菌中发现的基因），在体外杀死耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。这是 CRISPR 系统作为治疗 MDR 细菌的抗菌剂的非病毒递送的首次研究。Rodrigues等人使用粪肠球菌和编码CRISPR-Cas的结合质粒来降低肠球菌群体的抗生素耐药性。Citorik 等人使用偶联递送和噬菌粒递送来靶向 blaSHV-18 系列或者 blaNDM-1。

使用基于噬菌体的载体作为噬菌体疗法将 CRISPR-Cas 系统递送到目标细菌中目前存在一些局限性，包括宿主范围窄、细菌耐药性、安全问题和噬菌体清除。

关于窄宿主范围问题，噬菌体吸附需要识别并结合细菌宿主表面的特定结构，或者换句话说，需要高物种或菌株特异性。这些问题的主要解决方案包括修饰受体结合域或修饰噬菌体以表达细菌生物膜降解酶。

细菌中噬菌体抗性的进化是不可避免的。细菌可以通过突变和其他机制产生耐药性。然而，根据“权衡”进化原理，获得对噬菌体的抗性可能伴随着毒力的降低或细菌适应性的降低。细菌可以阻断噬菌体DNA注射，使用 Cas 核酸酶或酶降解噬菌体载体中的外源 DNA ，并干扰噬菌体DNA复制和噬菌体组装以实现噬菌体抗性。噬菌体混合物是不同噬菌体的组合，提供了一种降低噬菌体抗性的方法。

关于安全问题，在CRISPR-Cas系统递送过程中，噬菌体还可能通过劫持的广义转导递送宿主移动遗传元件，并导致毒力基因的后续传播。Park等人从金黄色葡萄球菌宿主菌株中去除了毒力因子基因，以防止噬菌体裂解物中的污染，因为葡萄球菌毒力因子通常位于可移动的遗传元件中。噬菌体递送的 CRISPR-Cas 的安全性问题仍需要进一步研究。

关于药代动力学问题，与传统噬菌体疗法类似，噬菌体在靶组织或器官中的分布至关重要。使用噬菌体递送的 CRISPR-Cas 作为针对目标细菌的抗菌剂也需要足够的滴度和时间。包封是一种改善噬菌体吸附和分布的方法，通过逃避免疫反应、胃酸和富含酶的组织液或自由基来增加循环时间。

由于抗生素耐药细菌的迅速出现，对抗传染病变得越来越困难。对噬菌体疗法的重新兴趣和CRISPR-Cas抗菌剂的发展趋势为抗菌素耐药性提供了新的治疗方法。对噬菌体疗法的进一步研究可能会改善使用基于噬菌体的载体的CRISPR-Cas系统的递送，未来应进行更多关于噬菌体疗法的RCT和关于噬菌体递送的 CRISPR-Cas 抗菌剂的新研究。

参考文献：

Yeh, T. K., Jean, S. S., Lee, Y. L., Lu, M. C., Ko, W. C., Lin, H. J., Liu, P. Y., & Hsueh, P. R. (2022). Bacteriophages and phage-delivered CRISPR-Cas system as antibacterial therapy. International journal of antimicrobial agents, 59(1), 106475. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2021.106475