研究背景

昆虫细胞因其高效的蛋白表达能力和相对简单的糖基化修饰，被广泛用于重组糖蛋白的生产，包括疫苗和治疗性抗体等。然而，昆虫细胞的糖基化修饰能力一直被认为较为有限，主要产生寡甘露糖型和简单截短的N-糖链。近年来，随着对昆虫细胞糖基化研究的深入，科学家们发现昆虫细胞可能具有更复杂的糖基化修饰能力，尤其是在非哺乳动物来源的重组蛋白中，可能存在一些未被充分认识的糖链结构。

近期，一项发表在《Molecular & Cellular Proteomics》杂志上的研究引起了广泛关注。该研究揭示了昆虫细胞（包括High Five细胞和Sf9细胞）在表达重组糖蛋白时，会产生具有两性离子特性的N-糖链结构。这些糖链不仅存在于天然蛋白中，还出现在流感病毒血凝素和新冠病毒S蛋白等重组蛋白上，可能对疫苗和其他生物制剂的研发产生重要影响。

研究内容

图 1  High Five细胞和Sf9昆虫细胞系的N-糖链分析

研究人员利用MALDI-TOF MS/MS糖组学技术，对两种细胞系的N-糖链进行分析，发现均含有磷酸胆碱（PC）和岩藻糖（Fuc）修饰，部分糖链还结合己糖醛酸（如葡萄糖醛酸）或戊糖（如木糖）。例如，在Sf9细胞中鉴定出新型糖链结构「Fuc₁GlcA₁Xyl₁」，其磷酸胆碱修饰可通过氢氟酸处理后质谱峰的变化得以验证（图1）。

图 2 High Five细胞和Sf9细胞的糖蛋白质组学特征分析

通过LC-MS/MS糖蛋白组学分析，研究团队发现流感血凝素（HA）和SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）在昆虫细胞中表达时，其N-糖链同样携带PC和Fuc修饰。如图2所示，Sf9细胞表达的Spike蛋白同时含有PC修饰糖链和硫酸化糖链，且PC修饰糖链可与人类C反应蛋白（CRP）结合，提示可能激活先天免疫反应。

图 3 全原子分子动力学模拟揭示NPC1糖基化结构如何解释位点特异性糖基化模式

分子动力学模拟结果显示，NPC1蛋白的糖基化位点accessibility（可及性）决定了糖链类型。暴露于膜外的位点倾向于复杂糖链修饰，而靠近脂质双层的位点则保留寡甘露糖结构（图3），这为理解糖基化修饰的空间选择性提供了新视角。

在本研究中，研究团队运用了先进的LC-MS/MS糖蛋白质组学技术，并采用了创新的“开放搜索策略”（通过SugarQBits脚本实现），成功在Sf9细胞和High Five细胞中分别鉴定出1680条和1721条独特的糖肽序列。这一方法突破了传统数据库在识别未知糖链时的局限性，极大地丰富了对昆虫细胞糖基化修饰的认识。

与此同时，MALDI-TOF MS/MS糖组学技术被用于分析从蛋白质中释放出的N-糖链。结果显示，High Five细胞的糖链以二岩藻糖基化结构为主，而Sf9细胞则富含含有磷酸胆碱（PC）的新型糖链。这两种技术相互补充，全面揭示了这两种昆虫细胞系糖链的复杂多样性和细胞特异性，为深入理解昆虫细胞的糖基化模式提供了重要的数据支持。

研究结论

该研究为“糖基化工程”提供了新靶点，通过调控昆虫细胞糖基转移酶活性，有望减少免疫原性糖链的生成。目前，团队已将质谱数据提交至ProteomeXchange和GlycoPOST，为行业建立了参考数据库，推动生物制药领域对非哺乳动物表达系统糖链修饰的深入理解与应用优化。

参考文献：

https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2025.100981