研究背景：

非洲猪瘟致死率近100%，1920年起已扩散至60多国。2019年越南疫情导致600万头猪被扑杀，占全国存栏20%以上。由于病毒基因复杂，迄今无有效疫苗。

越南科学院团队首次在杆状病毒-Sf9昆虫细胞中成功表达非洲猪瘟关键抗原CD2v胞外域（CD2v-ED），并确定最佳生产条件，为亚单位疫苗研发奠定基础。

CD2v是病毒外膜糖蛋白，由EP402R基因编码，参与病毒入侵和免疫逃逸，是疫苗开发的潜在靶点。研究采用杆状病毒表达系统，优点是产量高、蛋白结构接近天然且安全。

研究方法：依托杆状病毒系统，精细开展实验

1. 重组杆粒提取

研究团队此前成功构建了携带非洲猪瘟病毒越南流行株VNUA/HY-ASF1的CD2v-ED-Foldon-His重组杆粒的DH10Bac大肠杆菌重组杆粒。在本研究中，携带该杆粒的大肠杆菌DH10 Bac菌株在含有50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL四环素和10 μg/mL庆大霉素的液体培养基中37°C过夜培养，随后通过碱裂解法提取杆粒。

2. 转染与重组杆状病毒制备

将携带CD2v ED-Foldon-His抗原基因的重组杆粒转染到Sf9细胞中以制备重组杆状病毒。6孔板每孔加2 mL Sf-900 II SFM＋1×10⁶ Sf9细胞，27 °C静置2 h让细胞贴壁。另取1 µg重组杆粒、10 µL Cellfectin II与250 µL Opti-MEM I轻轻混匀，室温孵15 min形成脂质体复合物；逐滴加入孔中，27 °C静置过夜。感染5天后收获培养物，4°C下1500 rpm离心10分钟，收集上清液（含重组杆状病毒），添加2%胎牛血清后于4°C避光保存，采用噬斑分析法测定病毒含量。

图 1 转染以创建携带表达CD2v ED-Foldon蛋白基因的重组杆状病毒

如图1（A-B），转染后Sf9细胞出现肿胀、核增大、生长停滞、脱落及裂解等现象，正常细胞则圆润规则。

3.     蛋白表达检测

转染混合物离心收集细胞，加入1×Laemmli缓冲液重悬，98 °C加热10 min使蛋白变性；冰浴后4 °C、13 000  rpm离心30 min，取上清进行Western blot，以Amersham Imager 680捕获CD2v ED-Foldon-His信号。如上图1C，Western blot检测显示，表达的CD2V ED-Foldon-His有三聚体（>100 kDa）和寡聚体（>250 kDa）两种形式。

4.     表达优化

为优化CD2v ED-Foldon-His在Sf9细胞中的表达，研究评估了感染复数（MOI）和感染时间这两个因素。优化表达时，用10⁸  pfu/mL病毒液感染12孔板内的Sf9细胞（5×10⁵/孔，2 mL Sf-900 II SFM+5 % FBS）。贴壁3 h后按MOI 1/5/10加病毒，3、5、7 dpi收样。以H5pII-His作标准曲线，ImageQuant TL 8.0定量，三次重复，双因素ANOVA（α=0.05）。

图 2 昆虫细胞中CD2v ED-Foldon-His蛋白的最优表达

结果显示，MOI 为 5 pfu/cell、感染后 5 天时，蛋白产量最高达 4.4 mg/L。MOI 为 10 时，3 天产量 3.5 mg/L，但随后因蛋白酶降解快速下降；MOI 为 1 和 5 时，5 天产量分别为 4 mg/L 和 4.4 mg/L，7 天显著降低。双因素 ANOVA 分析表明，感染时间影响（p=6.41e-15）大于 MOI（p=0.0007）。

研究意义：

1.本研究首次在杆状病毒 - 昆虫细胞系统中成功表达了非洲猪瘟病毒（ASFV）的寡聚体CD2v胞外域（CD2v ED），为开发针对ASFV的亚单位疫苗提供了全新的技术路径。

2.该成果为非洲猪瘟亚单位疫苗的研发提供了创新思路与技术方案，同时为利用杆状病毒 - 昆虫细胞系统高效表达重组蛋白打造了实用的操作范例，显著提升了重组蛋白的表达效率与产量。

未来研究方向：

1.深入评估CD2v ED-Foldon-His的免疫原性与保护效力。

2.探索在生物反应器系统中实现CD2v ED-Foldon-His的大规模生产，以满足疫苗生产的实际需求。

参考来源：

https://doi.org/10.15625/vjbt-21868