新型杆状病毒滴度测定法问世：24 小时内完成，成本更低且精准度高

杆状病毒表达系统是生产重组蛋白的重要工具，广泛用于医学和制药领域，但需精准测定病毒滴度以优化感染条件。传统方法如TCID₅₀、定量PCR等，或耗时数天，或依赖昂贵设备，结果还易受主观判断影响。

研究团队利用转基因细胞系Sf9-QE解决了这些问题，其基因组整合了至少7个EGFP转基因拷贝，被杆状病毒感染后能快速高强度表达EGFP，可通过荧光直观识别感染细胞。

图 1 使用Sf9-QE细胞进行杆状病毒滴度直接滴定的原理与策略

 如图1显示，Sf9-QE细胞仅在被病毒感染时发荧光，其EGFP基因由病毒早期启动子表达，故感染后早期即产生荧光；初次感染17小时后可能发生二次感染，理论上二次感染后至少20小时才发荧光。因此，在二次感染荧光出现前计数初次感染的荧光细胞，即可确定病毒滴度，此图清晰呈现了直接滴定法的核心原理。

实验方法与结果分析

1.转基因Sf9-QE细胞的EGFP拷贝数验证

通过实时定量PCR（qPCR），以GAPDH和EF1α为内参基因，对Sf9-QE细胞的基因组DNA进行检测，采用ΔCt法计算EGFP转基因的相对拷贝数，实验重复3次。

图 2 Sf9-QE细胞基因组中EGFP转基因及参考基因的qPCR分析

  qPCR结果显示，EGFP转基因拷贝数是GAPDH基因的3.49±0.12倍，是EF1α基因的7.00±0.33倍，表明Sf9-QE细胞基因组中至少整合了7个EGFP转基因拷贝，为病毒感染后快速高表达荧光蛋白提供了基础。

2.亚培养时间对直接滴定法的影响

分别使用亚培养后1、3、5、7天的Sf9-QE细胞，通过直接滴定法（计数荧光细胞）和传统TCID₅₀终点稀释法测定病毒滴度，在感染后12-48小时内每隔12小时观察荧光表达。

图 3 Sf9-QE细胞在不同传代天数下病毒感染后的荧光显微图

亚培养后1-3天的细胞，感染12小时后即显荧光且强度随时间增强，直接滴定法与TCID₅₀法测值无显著差异（p≥0.05）；亚培养5-7天的细胞，两种方法结果差异显著（p<0.05）。故直接滴定法需用亚培养3天内的细胞以保准确性。

3.病毒感染后最佳计数时间的确定

用亚培养3天的Sf9-QE细胞，在病毒感染后12-36小时内每3小时计数荧光细胞，以直接滴定法算滴度并与TCID₅₀法比较。

结果显示，感染后15-30小时，两种方法结果无显著差异（p≥0.05），24小时时最接近；超30小时因二次感染荧光细胞增多，准确性下降，故15-30小时为最佳计数窗口。

4.病毒浓度对直接滴定法的影响

将病毒进行10倍梯度稀释（10⁻²至10⁻⁶），感染Sf9-QE细胞后24小时计数荧光细胞，比较不同浓度下直接滴定法与TCID₅₀法的结果。发现荧光细胞数量随病毒浓度降低而减少，且各浓度下两种方法的滴度结果无显著差异（p≥0.05）。即使在高稀释度（如10⁻⁶）下，只要计数细胞数≥10，结果仍可靠，表明该方法不受病毒浓度影响。

5.多种重组病毒的滴度测定验证

选取表达TEV蛋白酶（rAc-polh-TEVp）、柯萨奇病毒A6-P1蛋白（rAc-polh-CVA6-P1）和呼吸道合胞病毒F蛋白（rAc-polh-RSV-F）的3种重组杆状病毒，分别用直接滴定法和TCID₅₀法测定滴度。

图 4 使用直接滴定法对不同重组病毒进行滴度测定的定量结果

如图4，3种病毒的滴度在两种方法中均无显著差异（p≥0.05），证实直接滴定法对不同重组杆状病毒均适用，具有良好的普适性。

研究意义：

1.病毒感染后15-30小时内计数Sf9-QE细胞的荧光信号即可完成滴度测定，全程约24小时，大幅缩短传统方法的数天时间，且无需昂贵设备，降低成本，减少主观误差，提升结果可靠性。

2.适用于多种重组杆状病毒，与传统TCID₅₀终点稀释法结果高度一致，能帮助科研人员快速掌握病毒感染效率，优化重组蛋白生产条件，缩短研发周期，为医学和制药领域重组蛋白研发生产提供高效工具。

3.为后续基于类似转基因细胞系的病毒检测方法开发提供参考，推动病毒滴度测定技术创新发展。

原文链接：

https://doi.org/10.3390/insects16040426