研究概要

IIV6为虹彩病毒科大型dsDNA病毒，其包膜蛋白118L已证实介导病毒-细胞识别，但受体未知。Sf9细胞（草地贪夜蛾来源）是研究IIV6侵染的体外模型。明确118L在Sf9细胞膜上的直接受体，不仅可解析IIV6早期入侵机制，也为靶向病毒-宿主互作的绿色防控提供靶点。该研究综合VOPBA、LC-MS/MS、分子对接与GST pull-down，首次鉴定过渡内质网ATP酶TER94为118L的功能受体，填补了该领域空白。

研究方法

病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）及分析

研究团队首先借助病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）探寻与IIV6的118L蛋白相互作用的细胞蛋白：将40μg膜蛋白经10% SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭，与His-tag纯化的118L蛋白孵育，再经抗多组氨酸抗体、碱性磷酸酶标记的二抗处理，通过BCIP/NBT显色，以PBS替代118L蛋白作为阴性对照。

图 1 病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）

结果显示，在分子量大于100kDa的位置出现清晰条带，表明存在特定结合的细胞蛋白，而胞质蛋白组分中未出现该条带（图1）。

为明确该结合蛋白的身份，研究人员从考马斯亮蓝染色的凝胶中切取对应条带进行LC-MS/MS分析。结果显示，过渡性内质网ATP酶（TER94）在鉴定出的蛋白中评分最高，成为首要候选蛋白。

蛋白-蛋白对接

图 2 用AlphaFold与ColabFold程序构建的3D结构

研究团队通过分子对接技术进一步探究两者的相互作用。利用AlphaFold和ColabFold程序构建118L与TER94的3D结构（图2）。

图 3 118L与TER94的分子对接及相互作用残基

并且经HADDOCK v2.4程序分析发现，TER94有13个氨基酸残基参与与118L的结合，涉及12个氢键和181个非键接触，充分证实了两者的相互作用能力（图3）。

GST pull-down实验

在杆状病毒表达系统中表达His-tag标记的TER94，在细菌表达系统中表达GST-tag标记的118L蛋白，将两者上清混合孵育后，用镍珠纯化His-tagged TER94，通过SDS-PAGE和western blot（抗GST单克隆抗体）检测相互作用。

图 4 His标签拉下实验验证118L与TER94的关联

将GST标签的118L与His标签的TER94蛋白混合后，用镍珠纯化His标签的TER94及其结合蛋白，经抗GST抗体检测，能清晰观察到特异性信号；而仅含GST标签（无118L）与TER94混合的对照组则无此信号。这直接证明了TER94与118L存在特异性相互作用。

研究亮点

首次发现TER94是IIV6包膜蛋白118L的结合蛋白，明确其在病毒入侵Sf9细胞中的关键作用。

通过VOPBA、LC-MS/MS、分子对接及pull-down实验等多手段，交叉验证了118L与TER94的特异性相互作用，结果可靠。

拓展了TER94在病毒-宿主相互作用中的功能认知，为虹彩病毒感染机制研究及防控提供新方向。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/jobm.70045