猪圆环病毒3型（PCV3）自2015年在美国首次发现后，已在全球多地流行，可导致猪出现多种病症，造成巨大经济损失，且因难以培养尚无商业化疫苗。而PCV3的衣壳蛋白（Cap）是理想的疫苗靶点，杆状病毒表达系统（BEVS）虽成功用于PCV2疫苗生产，但蛋白表达受细胞凋亡限制。

研究团队利用CRISPR-Cas9技术，敲除sf9细胞中Caspase-1和Dronc基因，构建出sgCasp1、sgDronc、sgDual三种细胞系，其中双敲除的sgDual细胞抗凋亡能力最强，能更稳定表达目标蛋白。

研究方法与实验结果

质粒构建与验证

构建了用于重组杆状病毒和敲除sf9细胞的5种质粒（如pEGFP-HI10-Cas9、pEGFP-sfu6-sgCaspase-1、pFAST-Dual-Cap等），通过PCR扩增目标片段、酶切鉴定和测序分析验证质粒构建结果。

图 1 用于重组杆状病毒和Sf9敲除细胞的质粒构建

酶切和测序结果显示，所有质粒构建正确；Western blot检测到重组杆状病毒表达的EGFP和Cap蛋白，测序确认sgCasp1（Caspase-1基因4bp缺失，效率75%）、sgDronc（Dronc基因5bp缺失，效率75%）、sgDual（双基因7bp缺失，效率62.5%）细胞构建成功，且生长速率与野生型一致。

重组杆状病毒拯救与敲除细胞生成

将重组质粒转染至sf9细胞，拯救出表达EGFP和PCV3 Cap的重组杆状病毒（AcV-EGFP、AcV-Cap）；利用CRISPR-Cas9系统，在sf9细胞中敲除Caspase-1和/或Dronc基因，经嘌呤霉素筛选得到3种敲除细胞（sgCasp1、sgDronc、sgDual），并通过测序确认基因敲除效率。

细胞抗凋亡能力评估

用302nm紫外线（UV）处理对数期sf9细胞，通过倒置荧光显微镜观察细胞形态，qRT-PCR检测凋亡相关基因（Caspase-1、Dronc、Caspase-3）的mRNA表达，评估基因敲除细胞的抗凋亡能力。

图 2 基因敲除细胞的抗凋亡能力评估

UV诱导凋亡后，sgDual细胞存活率最高，sgCasp1和sgDronc细胞存活率高于野生型；qRT-PCR显示，三种敲除细胞的Caspase-1、Dronc、Caspase-3基因表达量显著降低，且sgDual细胞的凋亡基因表达最低。

杆状病毒复制与蛋白表达检测

感染重组杆状病毒后，通过qRT-PCR检测病毒启动子基因（Hr3）的表达，Reed-Muench法计算病毒滴度（TCID₅₀），评估病毒复制能力；采用SDS-PAGE和Western blot检测EGFP和PCV3 Cap蛋白的表达量。

图 3 杆状病毒在基因敲除Sf9细胞中的复制情况

如图，sgDual细胞中，病毒Hr3基因表达量和病毒滴度在感染后3-4天显著高于野生型；EGFP和Cap蛋白表达量在3-4天也显著升高，其中sgDual细胞的Cap表达量最高。

小鼠免疫实验

将18只BALB/c小鼠分为3组（Mock组、野生型sf9细胞疫苗组、sgDual细胞疫苗组），经两次肌肉免疫后，通过ELISA检测血清抗体水平，CCK-8法检测淋巴细胞增殖能力，qRT-PCR检测细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10）的mRNA表达，评估疫苗免疫效果。

图 4 PCV3 Cap亚单位疫苗在小鼠中的免疫应答

小鼠免疫实验显示，sgDual细胞疫苗组的血清抗体水平在7-28天均显著高于野生型疫苗组；淋巴细胞增殖能力在28天显著更强；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的mRNA表达量也显著更高，表明其能同时增强体液免疫和细胞免疫。

研究亮点：

靶点精准：一次性敲除Sf9细胞中两个关键凋亡基因——Caspase-1和Dronc。

产量翻倍：Cap蛋白表达量在“双敲”细胞中比野生型提升最高达2倍以上。

免疫升级：小鼠血清抗体滴度、淋巴细胞增殖率及Th1/Th2细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10）表达均显著优于传统Sf9制备疫苗。

技术平台：为PCV3乃至其他兽用重组疫苗的大规模生产提供了“升级版”昆虫细胞工厂。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2025.110452