无微载悬浮培养：火鸡疱疹病毒疫苗的工业化革命

原创

来源：范丽莹

2025-08-14 11:50:37

126次浏览

核心提示：首次利用源自番鸭的连续悬浮细胞系（AGE1.CR），在无需微载体、无血清的化学限定培养基中高效扩增火鸡疱疹病毒（HVT），将病毒滴度从最初＜10⁴ FFU/mL 提升至＞10⁵ FFU/mL，为马立克氏病和多价禽用载体疫苗的规模化、低成本生产铺平了道路。

背景知识

马立克氏病病毒（MDV）是禽类最致命的肿瘤病毒之一，每年造成全球家禽业超 10 亿美元损失。火鸡疱疹病毒（HVT）作为 MDV 的弱毒亲缘株，不仅自身可用作活疫苗，还被改造成多价载体疫苗（表达 NDV、AIV、IBD 等抗原）。然而 HVT 严格细胞关联、滴度低，传统生产必须依赖鸡/鸭胚原代成纤维细胞：流程繁琐、批次差异大、需要大量无特定病原体（SPF）鸡蛋，难以满足 300 亿只鸡的全球免疫需求。

研究方法

1、细胞系筛选

比较 4 个番鸭（Cairina moschata）来源的连续细胞系—视网膜 AGE1.CR 及其 pIX 衍生株、体节 AGE1.CS 及其 pIX 衍生株，以及对照鸡源 DF-1 细胞。用 EGFP 标记的 HVT FC-126 株，通过共接种（co-seeding）与预铺（pre-seeding）评估贴壁感染效率。

2、悬浮培养体系建立

将 CR/CR.pIX 驯化为无微载体、化学限定（CD-U7）培养基的悬浮细胞；采用“双相 fed-batch”工艺：第 0 天以 2×10⁶ cells/mL 接种，MOI=0.001；加入不含 IGF-I 的 DMEM 诱导细胞聚集（300–700 µm），同时瞬时剥夺 IGF-I 作为代谢休克。

3、定量指标

病毒滴度：荧光灶形成单位（FFU/mL）；基因组拷贝：ddPCR 检测病毒 sORF1 与细胞 E1A 的相对量；形态学：NyONE 荧光扫描监测聚集体内 EGFP 信号扩散。

实验结果

1、贴壁模型

CR 细胞焦点数量最高，CS 次之，DF-1 几乎不感染；共接种比预铺提高 2–5 倍感染灶。

2、悬浮模型

初始滴度仅 2–3×10⁴FFU/mL；通过细胞聚集 + IGF-I 休克，CR 细胞 5 天后滴度升至 1.3×10⁵ FFU/mL；基因组拷贝/细胞从 200 增至 600–760；该工艺对培养基比例（DMEM∶CD-U7 从 1∶2 到 1∶1）及摇瓶类型（平底 vs 挡板）具有鲁棒性；无聚集的 CD-U7 对照滴度低于输入水平。

3、产品质量

冻存复苏后细胞活力 >90%，病毒滴度下降 <0.3 log，符合后续卵内接种需求。

结论

本研究首次证明番鸭 AGE1.CR 连续细胞系可在无微载体、无血清、化学限定培养基中高效增殖 HVT；通过“细胞聚集 + 代谢休克”策略，可将滴度稳定提升到商业疫苗需求（>105 FFU/mL）；该工艺摆脱了对 SPF 鸡蛋与原代细胞的依赖，具备放大至 50–500 L 一次性生物反应器的潜力，为全球马立克氏病及多价禽用载体疫苗的可持续、低成本供应提供了可行路径。

参考来源：

Mähl K, Horn D, Abidi S, Kaufer BB, Sandig V, Karlas A, Jordan I. Replication of Vectored Herpesvirus of Turkey (HVT) in a Continuous, Microcarrier-Independent Suspension Cell Line from Muscovy Duck. Vaccines (Basel). 2025 Jun 30;13(7):714. doi: 10.3390/vaccines13070714. PMID: 40733691; PMCID: PMC12298404.