一、研究背景与问题

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）是肝炎-心包积液综合征（HHS）的主要病原体，对全球家禽业造成巨大经济损失。目前预防该病主要依赖灭活疫苗，但其生产面临严峻挑战：

传统工艺瓶颈：现有疫苗生产依赖贴壁培养的LMH细胞（Leghorn Male Hepatoma cell line）。该细胞需在滚瓶或细胞工厂中培养，存在设备占地大、人力成本高、难以大规模放大等问题。

产能限制：贴壁细胞扩增效率低，病毒产量有限，制约疫苗供应。

血清依赖风险：培养过程中添加的胎牛血清（FBS）可能引入外源污染风险，且成本高昂。

因此，开发一种适应悬浮无血清培养、支持高效病毒复制的LMH细胞系，成为提升FAdV-4疫苗生产效能的迫切需求。

二、研究方法

分阶段悬浮驯化与优化

研究团队对贴壁LMH-TB细胞（ATCC CRL-2177）进行了系统性悬浮驯化：

分阶段驯化策略

第一阶段（含血清过渡）：在SF003/Celer-S101S（1:1）培养基中添加2% FBS，传代培养11代（LMH-MB1）。

第二阶段（无血清适应）：一组换用无血清SF003/Celer-S101S（1:1）培养基，传代至第19代，最终获得稳定悬浮细胞系LMH-MB。

另一组换用无血清SF003/50% Tac-S101S（1:1）培养基，获得悬浮细胞系LMH-ME。

长期稳定性验证：两种细胞系均连续传代至62代，监测细胞密度、存活率、直径及比生长速率（μ）。

关键参数优化

针对FAdV-4（FAV-C4株）在LMH-MB中的增殖，优化五大参数：初始细胞密度（ICD）；感染复数（MOI）；收获时间（HT）；培养温度（IT）；适用细胞代次（P）。

疫苗制备与评价

1.在400L生物反应器中规模化培养病毒，甲醛灭活后制备油佐剂疫苗。

2.通过SPF鸡免疫攻毒试验评估保护率，并检测中和抗体水平。

三、研究结果：高效复制与全面保护

成功驯化悬浮细胞系

LMH-MB与LMH-ME在35-62代保持稳定生长，细胞存活率>90%，比生长速率μ>0.34 d⁻¹（图1A,B,C）。

移除血清后细胞直径减小，活率显著提升（>95% vs. 含血清时80%），推测血清中金属离子（Ca²⁺/Mg²⁺）诱导的细胞团块限制了营养摄取（图1B,D）。

病毒产量跃升10倍

FAdV-4在悬浮LMH-MB和LMH-ME中的复制效价（TCID₅₀）达10⁸^.⁰/mL，是贴壁LMH-TB细胞的10倍（图1E）。

关键机制：悬浮细胞中FAdV-4受体CAR的表达量显著高于贴壁细胞（p<0.001），且LMH-MB的CAR表达在72小时内维持高水平（图1H,I）。

高效灭活疫苗保护率达100%

基于LMH-MB生产的灭活疫苗（剂量≥10⁶^.⁶⁴ TCID₅₀/只）对SPF鸡提供100%免疫保护（图2F），攻毒后无HHS临床症状（图2G）。高剂量组（10⁶^.⁹⁴/10⁶^.⁶⁴ TCID₅₀）中和抗体水平达15.36/15.5 log₂，显著优于低剂量组（13.79 log₂）。

广谱病毒复制能力

LMH-MB细胞可高效扩增多种禽病毒：

禽呼肠孤病毒（ARV，TCID₅₀=10⁶.³/0.1mL）

鸭坦布苏病毒（DTMUV，TCID₅₀=10⁸.⁰⁷/0.1mL）

H9N2禽流感病毒（HA效价=9 log₂）

鹅星状病毒（GoAstV，TCID₅₀=10⁷.⁶⁴/0.1mL）

感染后出现特征性细胞病变（CPE）（图2H,I）。

四、结论与展望

该研究通过无血清悬浮驯化技术，成功将贴壁LMH细胞转化为高适应性悬浮细胞系LMH-MB，并实现三大突破：

颠覆性产能提升：FAdV-4病毒产量提高10倍（达10⁸^.⁰ TCID₅₀/mL），为规模化疫苗生产奠定基础。

平台化应用潜力：LMH-MB支持多种重要禽病毒的高效复制，有望成为多联禽疫苗开发的通用细胞基质。

成本与安全性优势：悬浮培养摒弃血清，降低污染风险和成本，且甲醛灭活的细胞基质无致瘤性，符合疫苗安全标准。

展望：该平台有望加速高性价比禽用灭活疫苗的产业化进程，并为应对新发禽病毒疫情提供快速响应的技术储备。

参考来源：https://doi.org/10.1016/j.psj.2025.105424