研究背景

近期，全球范围内抗生素耐药性问题的加剧引起了广泛关注。美国疾病控制与预防中心（CDC）报告称，耐药性细菌感染导致的死亡人数正在上升。也正是抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题已经成为了全球公共卫生的重大挑战。世界卫生组织（WHO）多次警告，如果不采取有效措施，抗生素耐药性可能导致“后抗生素时代”的到来，许多常见感染将变得难以治疗。噬菌体作为一种特异性感染细菌的病毒，其裂解酶（Endolysin）因其高效的抗菌活性和较低的耐药性风险而受到广泛关注。然而，大多数已知的噬菌体裂解酶主要针对革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌的活性较弱。因此，寻找能够有效裂解革兰氏阴性菌的新型裂解酶具有重要的科学和应用价值。

研究方法

1.基因合成与克隆：研究人员通过化学-酶法合成了EndoA3的基因，并将其克隆到pET28a质粒中。

2.蛋白表达与纯化：在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导EndoA3的表达，并通过DEAE-Sepharose和磷纤维素柱层析纯化蛋白。

3.酶活性测定：使用Shugar方法测定EndoA3对不同细菌的裂解活性，通过光谱法监测细菌悬液吸光度的变化。

4.结构分析：利用核磁共振（NMR）和动态光散射（DLS）技术分析EndoA3的结构和溶液中的行为。

5.钙离子结合分析：通过等温滴定量热法（ITC）测定EndoA3对Ca2+的结合常数。

研究结果

噬菌体肽酶在进化上的复杂性和多样性：用一幅未根化的最大似然法构建的进化树，展示了具有类似EF-hand钙离子（Ca2+）结合环的噬菌体肽酶的氨基酸序列之间的进化关系。为了便于观察，同一组内关系密切的分支被折叠起来，并在括号中给出了每组内折叠的序列数量。该进化树的比例尺是根据每个位点的替换次数来调整的，即分支长度表示该组内的氨基酸替换频率。揭示了噬菌体肽酶在进化上的复杂性和多样性，同时也强调了Ca2+结合环在这些酶中的普遍性和重要性。

EndoA3活性与特异性测试：EndoA3的裂解活性在pH 8.5–9.5之间达到最佳，表明该酶在碱性环境中活性最高（图2A）。在50 mM的缓冲液浓度下，EndoA3的活性最高，而在过高或过低的缓冲液浓度下，活性会降低（图2B）。在含有Zn2+的反应混合物中，EndoA3的活性受到显著抑制，这表明Zn2+对该酶有抑制作用（图2C）。此外，非离子型去污剂Triton X-100能够提高EndoA3的活性，可能是通过增加底物的可及性。EndoA3是一种热敏感酶，在50°C时仍能保持活性，但在60°C时活性会显著下降，且在更高温度下会完全失活，这种失活是不可逆的（图2D）。

EndoA3对肽模拟物GMTP的水解作用：通过NMR谱图的变化，研究人员确定了EndoA3对GMTP的水解位点（图3A）。EndoA3在L-丙氨酸（L-Ala）和D-谷氨酸（D-Glu）之间的肽键处进行水解，这表明EndoA3是一种L-丙氨酸-D-谷氨酸肽酶（图3B）。EndoA3对肽聚糖的特异性水解作用表明其在细菌细胞壁的降解过程中具有特定的靶点，这可能与其在噬菌体裂解过程中的作用机制有关。NMR 谱图提供了详细的分子结构信息，通过比较底物和产物的谱图，研究人员能够精确地确定酶的水解位点和作用机制。这种技术的应用为研究酶的活性和作用机制提供了有力的工具。

EndoA3对Ca2+依赖性的验证：螯合剂（如 EGTA、EDTA 和 BAPTA）显著抑制了EndoA3 的活性，表明这些螯合剂通过结合Ca2+来阻止酶的活性。这些结果证实了Ca2+在EndoA3活性中的关键作用，因为螯合剂通过移除Ca2+来抑制酶的活性。在螯合剂抑制后，通过添加 Ca2+或 Mn2+可以完全恢复EndoA3的活性。这表明Ca2+和Mn2+在酶的活性中起着重要的调节作用。Mn2+的恢复效果表明，虽然Ca2+是 EndoA3 的天然激活剂，但Mn2+也可以在体外实验中有效地替代Ca2+。与对照组相比，螯合剂处理后的活性显著降低（p < 0.001），而添加Ca2+或Mn2+后活性显著恢复（p < 0.001）。这些统计学结果进一步支持了Ca2+和Mn2+在 EndoA3活性中的关键作用。

等温滴定量热法（ITC）分析：Ca2+与 Zn2+-EndoA3的结合是一个单一位点过程，每个EndoA3 分子上有一个Ca2+结合位点。这表明Ca2+的结合具有高度特异性。解离常数（Kd）值为 (1.4 ± 0.1)×10⁻⁴ M，表明Ca2+与 Zn2+-EndoA3的结合亲和力较低。这一结果与EndoA3在宿主细胞周质中激活的机制一致，因为周质中的Ca2+浓度较高，足以激活EndoA3。ΔG为21.9 ± 0.7 kJ/mol，表明Ca2+与 Zn2+-EndoA3的结合是一个吸热过程，需要外界提供能量。这可能与Ca2+结合引起的构象变化有关，这种变化有助于激活EndoA3的催化活性。通过单一位点结合模型的拟合，数据点与模型吻合良好，表明Ca2+与 Zn2+-EndoA3的结合是一个简单且特异性的过程。

EndoA3在不同形式下的结构变化：远紫外CD谱图显示，Ca2+的结合对EndoA3的二级结构没有显著影响，表明Ca²⁺的结合不改变蛋白质的折叠状态（图6A）。近紫外CD谱图显示，Ca2+的结合使蛋白质的三级结构更加紧凑，这可能与活性中心的形成有关（图6B）。¹H NMR 谱图显示，Zn2+和Ca2+的结合导致蛋白质核心的堆积密度增加，并逐步形成活性中心。Zn2+的结合首先使活性中心的组氨酸残基固定，而Ca2+的结合进一步稳定活性中心，使其达到催化活性状态（图6C）。结果表明，EndoA3的活性中心形成需要 Zn2+和Ca2+的共同作用。Zn2+提供催化活性，而Ca2+则通过稳定活性中心的构象来激活酶。

结论与展望

EndoA3的发现为开发新型抗菌药物提供了新的思路。其对革兰氏阴性菌的高效裂解活性和对Ca2+的依赖性使其在抗菌治疗中具有潜在的应用价值。特别是在抗生素耐药性问题日益严重的背景下，噬菌体裂解酶作为一种新型抗菌手段，有望成为传统抗生素的有效替代品或补充。然而，从实验室到临床应用还有很长的路要走。未来的研究需要进一步探索EndoA3的作用机制，优化其生产过程，并进行临床前和临床试验，以验证其安全性和有效性。

参考文献链接：DOI：10.1016/J.IJBIOMAC.2025.146934