研究背景

狂犬病是致死性脑炎疾病，全球每年约 5-7 万人死亡、1000 万人接受暴露后治疗。传统兽用狂犬病疫苗生产依赖 BHK-21 等连续细胞系，但细胞增殖阶段需添加动物血清，存在多种风险，且高质量血清成本高昂。同时，欧美监管机构鼓励生物制品生产减少或消除动物源成分，因此亟需开发无血清 / 无动物蛋白培养基，替代仍在发展中国家使用的感染脑组织疫苗，实现安全、低成本的兽用狂犬病疫苗生产。

关键突破

BHK-21 细胞培养基适配

测试 2 种 SF 培养基（HyQ PF CHO、Ex Cell 520）与 3 种 APF 培养基（HyQ PF CHO MPS、Ex Cell 302、Rencyte BHK），通过直接切换或多步适应法实现细胞适配（表1）。

（1）T 瓶静态培养：

适配后的细胞在 4 种培养基中均能生长，其中 HyQ PF CHO 与 HyQ PF CHO MPS 表现最优（表2）。

（2）Spinner 摇瓶动态培养：

选择 HyQ PF CHO 与 HyQ PF CHO MPS 进行摇瓶培养（图 1），结果显示：

细胞生长：两种培养基中细胞生长趋势一致，4 天后生长停滞，最大细胞密度分别达 1.9×10⁶ cells/ml（HyQ PF CHO）与 2×10⁶ cells/ml（HyQ PF CHO MPS），比生长速率分别为 0.054 h⁻¹、0.048 h⁻¹。

代谢产物：HyQ PF CHO 中乳酸（18 mM）、氨（3 mM）积累量高于 HyQ PF CHO MPS（乳酸 10.5 mM、氨 2.7 mM），且氨浓度超过 BHK 细胞抑制阈值，推测氨积累是细胞生长停滞的主要原因；两种培养基停滞时残余葡萄糖浓度均高于葡萄糖米氏常数（Kₘ=0.8 mM），排除葡萄糖限制因素。

狂犬病病毒生产

（1）Spinner 摇瓶病毒产率：

BHK-21 细胞感染狂犬病病毒 PV 株（MOI=0.1）后，两种培养基病毒产率相近（图 2）：

HyQ PF CHO MPS：感染后 9 天达最大病毒滴度 1.7×10⁶ FFU/ml，3 天后细胞密度骤降。

HyQ PF CHO：感染后 10 天达最大病毒滴度 1.79×10⁶ FFU/ml，6 天后细胞密度开始下降。

病毒分泌均与细胞密度下降同步，证明两种培养基均适用于狂犬病病毒生产。

（2）2L 生物反应器优化：

重点优化培养模式、灌注速率与 MOI 三个关键参数：

培养模式：灌注模式利于细胞增殖（图 3），循环模式下细胞密度稳定但活性低，切换至灌注模式后细胞活性恢复；感染阶段需采用批次模式（因旋转过滤器易被细胞碎片堵塞）。

灌注速率：HyQ PF CHO MPS 中，0.33-0.38 反应器体积 / 天的恒定灌注速率最优（图 5、6），速率过高（＞0.38）会稀释细胞自分泌生长因子，导致细胞密度下降；此速率下细胞密度最高达 2.9×10⁶ cells/ml，葡萄糖消耗充足且乳酸积累可控。

MOI：MOI=0.3 时感染效率显著高于 MOI=0.1，感染后 2 天细胞感染率达 100%，4 天达最大病毒滴度 5.2×10⁵ FFU/ml（HyQ PF CHO）、1.3×10⁶ FFU/ml（HyQ PF CHO MPS）。

实验疫苗效价验证

采用 HyQ PF CHO MPS 培养基生物反应器培养产物制备疫苗（经 0.8μm 过滤澄清、β- 丙内酯灭活、添加稳定剂与氢氧化铝佐剂），通过 NIH 测试评估效价，实验疫苗保护效价达 1.5 IU/ml，符合 WHO 对兽用狂犬病疫苗的效价要求，可替代含血清培养基制备的疫苗（实验室规模含血清疫苗效价约 3 IU/ml，工业规模数据暂缺，无法直接对比）。

结论与展望

研究确定 HyQ PF CHO 与 HyQ PF CHO MPS 为 BHK-21 细胞生产兽用狂犬病疫苗的最优无血清 / 无动物蛋白培养基，明确 2L 生物反应器的关键工艺参数（灌注速率 0.33-0.38 反应器体积 / 天、MOI=0.3、增殖期灌注 / 感染期批次），制得的疫苗符合 WHO 标准，解决了传统血清培养基的污染风险与成本问题。

未来可进一步优化病毒株适配（经多代适应提升病毒滴度）、扩大反应器规模至工业级，并探索培养基成分对细胞自分泌因子的影响，进一步提升细胞密度与病毒产率，推动该工艺在发展中国家犬只大规模免疫中的应用。

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参考文献

Kallel H, Jouini A, Majoul S, et al. Evaluation of various serum and animal protein free media for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 95(2): 195-204.