耐胁迫噬菌体的分离与表征及其在食源性病原体生物防控中的应用

食源性微生物污染仍然是食品工业面临的重大挑战，影响公众健康并造成经济损失。噬菌体因其靶向抗菌活性、安全性以及重要的是对食品感官属性的影响最小而成为有前途的生物防治剂。然而，它们在食品加工条件下的稳定性仍然是实际应用的瓶颈。在这里，我们使用序贯应激暴露方案分离出三种靶向铜绿假单胞菌（一种新兴食源性病原体）的耐应激噬菌体。这些噬菌体在高达 50 °C、pH 4-11 和 20% NaCl 的情况下仍具有感染性。噬菌体能够将铜绿假单胞菌在人工污染奶酪中的生长减少 5 个对数。对其中一种噬菌体进行全基因组测序，确定应激耐受的基因组决定因素，并筛选抗生素耐药基因、毒力因子和溶原基因，确保作为生物防治剂的安全性。这项研究证明了耐应激噬菌体与传统食品加工技术结合使用时增强食品安全的潜力。

1、            1.环境样品中噬菌体富集与计数

在鱼市场样品中噬菌体数量最高（~2500 PFU/mL），污水和蔬菜市场样品中噬菌体数量较低，说明鱼市场是分离铜绿假单胞菌噬菌体的理想来源。

图1：C. coli vs C. jejuni 耐药率对比

2、             2.胁迫耐受性分析

盐胁迫：20% NaCl下仍保持活性，无明显下降

pH胁迫：在pH 4和pH 11下均稳定

温度胁迫：50°C下4小时仅轻微下降；70°C下30分钟下降3 log但仍存活

氯胁迫：0.5 ppm下显著下降，更高浓度无进一步影响噬菌体。

图2：不同压力因素对铜绿假单胞菌特异性噬菌体的存活率和感染力的影响。

3、             3.噬菌体纯化与形态鉴定

通过胁迫筛选后分离出3株形态不同的噬菌体，选择耐受性最强的噬菌体3（Pseudomonas phage_BARCO1）进行后续研究，电镜显示其结构完整，属于肌尾病毒科。

图3：分离并纯化具有明显形态差异（斑块形态）且具有抗压能力的噬菌体

4、            4.宿主范围与生长特性

噬菌体3对11株铜绿假单胞菌中的多数具有裂解活性，最佳MOI为100，潜伏期为30分钟，爆发量为600 PFU/细胞，表明其具有高效裂解能力和广宿主范围。

图4：耐胁迫噬菌体生物学特性

5.基因组分析与安全性评估

噬菌体3基因组大小为43,737 bp，GC含量62.4%（高于一般噬菌体），编码69个ORF，与衣壳合成、尾部纤维、DNA复制等相关；无抗生素抗性基因、毒力因子、溶原相关基因，属于Phikmovirus属，为新物种。

图5：热图及系统发育树

6.衣壳蛋白稳定性分析

主要衣壳蛋白含有疏水区、带电氨基酸、脯氨酸、甘氨酸等，精氨酸含量高，有助于形成盐桥和氢键，增强稳定性，半胱氨酸可能参与二硫键形成，增强结构稳定性，这些特性共同解释了其优异的胁迫耐受性。

图6：噬菌体_BARC01 的环状基因组图谱以及主要衣壳蛋白的氨基酸序列

7、            7.在奶酪中的应用效果

噬菌体处理组中的铜绿假单胞菌减少5 log，对照组的细菌大量生长，产生荧光（绿脓菌素），证明噬菌体在真实食品基质中仍保持高效抑菌能力。

图7：具有抗压能力的噬菌体控制人工污染奶酪中的铜绿假单胞菌污染

结论：顺序胁迫筛选法可有效富集耐胁迫噬菌体，噬菌体BARCO1 具有优异的温度、pH、盐耐受性，其基因组安全，无有害基因，适合食品应用，在奶酪中表现出强抑菌效果，具备实际应用潜力。

参考来源：10.1007/s11947-025-03885-8