支原体污染是兽用疫苗质量安全的重要风险点。作为一类无细胞壁的原核微生物，支原体可潜伏于细胞库、病毒种子、疫苗半成品及成品中，不仅干扰病毒增殖与抗原表达，还可能诱发接种动物呼吸道或生殖道炎症，削弱免疫效果，甚至造成免疫失败。本文结合《中国药典》2025 版三部通则 3301 支原体检查法，系统梳理兽用疫苗全生命周期中的支原体检测技术与场景化解决方案，助力企业构建合规、高效、可持续的生物安全防护网。

一、法规框架：药典要求与疫苗生产全链路检测点

《中国药典》3301 支原体检查法明确：主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、病毒种子批、对照细胞及临床治疗用细胞须同时进行“培养法+指示细胞培养法（DNA 染色法）”双法验证；病毒收获液、原液可优先采用培养法，必要时以指示细胞法复核，也可使用经国家药品检定机构认可的其他方法（如 qPCR）。

  兽用疫苗生产链条长、环节多，建议将支原体监控前移至以下 6 个关键节点：

 1.引种细胞或原代细胞入场

 2.建库（MCB/WCB）

 3.病毒种子批制备

 4.上游发酵/细胞培养过程

 5.下游纯化收获液

 6.成品放行及稳定性考察

二、培养法：经济可靠的“金标准”及其场景化应用

 1. 培养基组合与灵敏度要求

 药典推荐培养基有支原体液体培养基、支原体半流体培养基和支原体琼脂培养基：

      （1）支原体液体培养基

 支原体肉汤培养基（含葡萄糖、酚红）适用于发酵支原体、猪肺炎支原体等快速利用葡萄糖产酸的株型，灵敏度需达到 10⁻⁸（ATCC 15531）

①支原体肉汤培养基

猪胃消化液　500ml

氯化钠　2.5g

牛肉浸液（1∶2）　500ml

葡萄糖　5.0g

酵母浸粉　5.0g

酚红　0.02g

pH 7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  精氨酸支原体肉汤培养基（含 L-精氨酸）适用于利用精氨酸产碱的口腔支原体等，灵敏度需达10⁻⁴（ATCC 23714）

②精氨酸支原体肉汤培养基

猪胃消化液　500ml

葡萄糖　1.0g

牛肉浸液（1∶2）　500ml

L-精氨酸　2.0g

酵母浸粉　5.0g

酚红　0.02g

氯化钠　2.5g

pH 7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（2）支原体半流体或琼脂培养基

  半流体或琼脂培养基用于观察菌落形态，防止液体培养出现假阳性结果

2. 场景化应用流程（21+21 天培养程序）

（1）采样：每批样品 2–8 °C 保存不超过 24 h，或 –20 °C 以下长期保存

（2）接种：液体培养基 4 支/批，半流体 2 支/批，每支接种 0.5–1.0 mL

（3）培养：36 °C ± 1 °C，21 天；第 7 天取 2 支液体培养物进行次代转接，再培养 21 天

（4）判定：无颜色变化或无微生物生长样浑浊即为合格；若可疑，加倍复试；仍阳性则判不合格

三、指示细胞法（DNA 染色法）：快速筛查与“眼见为实”

1. 技术原理

   将供试品接种于无支原体污染的 Vero 细胞（或 PK-15、ST 等兽用敏感细胞），共培养 3–5 天后，用 Hoechst 33258 荧光染料染色。支原体 DNA 富含 AT 区，可被染料特异性结合，在荧光显微镜下呈现大小不等、不规则的荧光颗粒。

2.关键试剂（现配现用）

 （1）浓缩液：5 mg Hoechst 33258 → 100 mL 无酚红 HBSS，−20 °C 避光。

 （2）工作液：1 mL 浓缩液 + 99 mL 无酚红 HBSS。

 （3）固定液：醋酸∶甲醇 = 1∶3。

 （4）封片液：pH 5.5 柠檬酸-磷酸盐缓冲甘油。

3. 应用场景

       （1）细胞库放行：每批 MCB/WCB 均需双法验证，指示细胞法可在 5 天内完成初筛

       （2）毒种外源因子复检：对病毒种子批进行支原体快速排查，降低后续生产风险

四、培养基质量与供应链：灵敏度是“生命线”

  培养基灵敏度直接决定方法可靠性。药典要求每批培养基进行“变色单位（CCU）试验”，企业可使用肺炎支原体和口腔支原体自行评估，也可委托具备 CNAS 资质的第三方实验室完成，质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。

  支原体检测不是“做一次就过关”的单点任务，而是贯穿兽用疫苗全生命周期的系统工程。以2025版《中国药典》3301 法为核心，企业应根据不同场景灵活组合“培养法+指示细胞法+qPCR”三线技术，建立与工艺深度耦合的监测方案；同时通过高质量培养基、标准化菌种库、数字化质量平台，形成“预防-检测-追溯-改进”闭环。唯有如此，方能在全球动物疫苗市场竞争中守住生物安全底线，为畜牧业健康发展和食品安全保驾护航。