支原体“隐身衣”被撕开：二代测序在兽医疫苗领域的“逆袭”！

研究背景

近年来，兽医疫苗在防控动物疫病方面发挥了重要作用，但疫苗生产过程中的微生物污染问题始终是一个隐患。其中，支原体污染因其可能严重影响动物健康和疫苗效果而备受关注。支原体是一类没有细胞壁的细菌，能够感染多种动物宿主，并导致巨大的经济损失。由于其缺乏细胞壁，支原体对许多抗生素具有天然耐药性，增加了防控难度。此外，支原体能够在细胞培养和生物制品中隐性污染，难以被及时发现。目前，韩国等国家主要依赖PCR技术检测支原体，但PCR在面对含有猪红斑丹毒杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）和猪瘟病毒（CSFV）等成分的疫苗时，容易因引物与非目标序列的相似性导致非特异性扩增，从而产生假阳性结果。为解决这一问题，研究团队引入了NGS技术，以期提供更精准、高效的检测方法。

研究方法

细菌菌株选择：研究选用了国际兽药注册技术要求合作组织（VICH）推荐的五种支原体及相关细菌，包括Acholeplasma laidlawii和四种支原体（Mycoplasma fermentans、Mycoplasma orale、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma synoviae），以及猪红斑丹毒杆菌（E. rhusiopathiae）。

样本制备：将E. rhusiopathiae和支原体菌株分别稀释后混合，模拟实际疫苗中的复杂成分。同时，设置了仅含支原体的样本组和阴性对照组。

DNA提取：使用自动化核酸提取平台和磁珠法提取样本DNA。

PCR扩增与测序：设计引物扩增16S rRNA区域，使用MaximeTM PCR premix进行扩增，随后进行NGS测序。

数据分析：参考基因组比对方法：利用BBMap和SPAdes工具，通过两步比对策略（先比对E. rhusiopathiae基因组，再比对支原体数据库）进行序列分析和基因组重建。

元条形码分析方法：使用Qiime2和MicrobiomeAnalyst工具，进行序列去噪、特征表构建、系统发育分类等分析。

研究结果

传统PCR检测限：通过展示不同支原体物种使用三种分析方法（传统PCR、参考基因组比对和元条形码分析）的检测限，对五种支原体的检测限进行了评估。发现不同支原体的检测限存在差异，例如A. laidlawii为3.1 log CFU/mL，M. fermentans为3.0 log CFU/mL等（表3）。这表明PCR在低浓度支原体检测中的效率有限。

参考基因组比对方法的精准检测能力：总结了五种支原体在α×101稀释度下，经过不同处理步骤后的输出序列数量及占原始序列的百分比。该方法能够有效过滤非特异性序列，准确重建支原体来源的序列片段，并且通过两步比对策略显著减少了非特异性序列的干扰（表4）。

元条形码分析的全面检测能力：元条形码分析能够提供样本中微生物群落的相对丰度信息，研究展示了在不同稀释度下五种支原体的相对覆盖率和相对丰度（表5）。并且在支原体浓度变化时展现出相应的定量特征。然而，该方法更容易受到非特异性序列的影响。

阴性疫苗样本分析：参考基因组比对方法在31个阴性疫苗样本中检测到支原体特异性序列片段，而元条形码分析未检测到支原体相关序列。进一步的培养测试未发现微生物生长，这可能支持元条形码分析的结果，但也存在极少量支原体未被培养出或实验室污染的可能。

结论与展望

在非洲猪瘟和猪瘟等重大动物疫病频发的背景下，疫苗的质量和安全性直接关系到疫病防控效果和养殖业的稳定发展。韩国研究团队将NGS技术引入兽医疫苗支原体污染检测领域，为解决传统PCR技术的局限性提供了新思路。本研究成功开发并验证了基于NGS的支原体污染检测方法，其中参考基因组比对方法在灵敏度、特异性和定量能力方面均优于传统PCR和元条形码分析，可作为兽医疫苗质量控制的有力工具。将NGS技术应用于疫苗检测，不仅能显著提高检测效率和准确性，还能有效解决PCR技术在特定疫苗检测中的假阳性问题，从而增强疫苗的质量和安全性，保障养殖业的健康发展。

我国是养殖大国，兽医疫苗市场需求庞大。相关部门和企业应重视此类新技术的研究与应用，加强与国际科研团队的合作交流，不断提升我国兽医疫苗的质量检测水平和生产技术，确保动物产品的安全和公共卫生安全。同时，政府应加大对新型检测技术的研发投入，制定相关政策鼓励企业采用先进检测手段，推动我国从养殖大国向养殖强国迈进。

参考文献链接：DOI 10.3389/fvets.2025.1657098