五基因缺失减毒沙门氏菌疫苗问世：对雏鸡毒力降10倍，保护力达80%

研究背景与意义

Salmonella Enteritidis（SE）是我国禽源食源性沙门ellosis的首要血清型，蛋鸡、肉鸡感染后可导致腹泻、死亡及垂直传播，污染蛋品、禽肉后直接进入人类食物链。WHO将其列为全球四大腹泻病原之一。抗生素滥用促使耐药株不断出现，传统灭活苗免疫原性弱、程序复杂，而活疫苗存在毒力返强隐忧。利用基因工程定向缺失毒力与合成相关基因，可在“减毒”与“保留免疫原性”之间取得平衡，是国际公认的活疫苗研发路径。

研究方法

以山东临床分离株SD01为亲本，借助等位基因交换技术依次敲除asd（DAP合成必需）、crp（环磷酸腺苷受体蛋白）、rfaL（LPS核心连接酶）、rffG（表面多糖合成调节）、rfbB（O-抗原合成）五基因，获得营养缺陷型突变株SD01ΔMg。通过雏鸡口服LD50、细胞侵袭、蜡螟/小鼠存活试验评价毒力；以ELISA、qPCR、病理切片比较免疫组与对照的体液、黏膜及细胞因子应答；最后以50×LD50剂量攻毒测定保护效力。

研究结果分析

五基因缺失毒力显著下降

表1显示，一日龄雏鸡口服LD50测定中，SD01ΔMg的LD50为1×10⁹ CFU，而亲本SD01仅7×10⁷ CFU，毒力下降约10倍；图1F小鼠存活曲线亦表明，107 CFU腹腔注射后SD01组7天内全部死亡，而突变株9天才开始死亡，存活率提高。

生长不受影响，表型由光滑→粗糙

图1A生长曲线可见，SD01ΔMg与亲本在LB培养基中OD600变化完全一致，说明缺失未影响体外增殖；然而盐凝集与结晶紫染色（图S2）显示突变株呈典型粗糙型（颗粒凝集、菌落染成紫红色），提示LPS结构改变，与毒力下降相符。

细胞侵袭与体内定植能力减弱

图1B-C：SD01ΔMg对HeLa和RAW264.7细胞的黏附、侵袭及10 h胞内增殖量均比亲本降低4-8倍（p＜0.01）。

图2A-B：口服5×10⁸ CFU后，肝脏、脾脏载菌量在第3天达峰后迅速下降，第13天已检测不到活菌；而亲本在肝脾持续高载，表明突变株定植受限、清除更快。

免疫后抗体与细胞因子水平显著提升

图3B-C：两次口服免疫后，血清IgG与肠洗液IgA在第4周达到峰值，SD01ΔMg组与商用Sm24/Rif12/Ssq苗差异不显著，但均显著高于空白组（p＜0.01）。

图3D-H qPCR结果显示，IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α在免疫后14-21天显著上调，提示Th1/Th2平衡激活；IL-1β早期升高后快速回落，反映炎症可控。

攻毒保护效果显著

表1与图4共同表明：免疫15天后以50×LD50亲本株攻毒，11天观察期内：

SD01ΔMg组死亡率仅20%（6/30），保护率80%；

空白组体重平均下降80 g，肝脾载菌量高3 log（图2C-D、图3A）；

病理切片（图4）显示，空白及亲本感染组小肠绒毛脱落、肝灶性坏死、脾白髓出血；而SD01ΔMg免疫组肠绒毛结构完整，肝脾未见明显病变，与商用苗组相当。

研究结论

SD01ΔMg通过五基因同步缺失实现“营养缺陷+毒力削弱+免疫原性保留”三重优势：体外生长不受影响，体内定植与毒力下降一个数量级，口服两次即可诱导高强度体液-黏膜-细胞免疫，攻毒后保护率达80%，显著减轻组织病理损伤。其DAP依赖特性保证环境安全性，粗糙表型有望提升交叉保护广度。该研究为我国禽源Salmonella Enteritidis提供了一款机制清晰、安全高效、适合规模化生产的活疫苗候选株，也为其他血清型减毒疫苗平台提供了可复制、可扩展的技术路线。

参考来源：https://doi.org/10.1016/j.vetvac.2025.100145