“甩掉血清”的小鼠干细胞时代：一瓶成分全公开、胆固醇掌控生死的DARP培养基

本研究围绕“如何为小鼠多能干细胞建立一套成分完全公开、无血清且化学定义明确的培养体系”这一核心问题展开。传统胚胎干细胞培养依赖胎牛血清，其成分复杂、批次差异大，严重阻碍实验可重复性与机制解析；即便已有的无血清方案，也普遍使用商业添加剂如KSR或B-27，配方保密，仍不利于精确研究。作者先前开发的DA-X无血清基础液虽可维持多种癌细胞，却未经验证是否适用于干细胞。本文通过逐步优化DA-X，最终衍生出名为DARP的新配方，首次实现小鼠原始态胚胎干细胞与激发态上胚层干细胞在同一开放体系下的长期稳定扩增，并系统揭示了胆固醇对不同pluripotency状态的截然相反作用。

在原始态mESC培养中，研究首先确认DA-X必须联合2i、LIF及β-巯基乙醇才能支持存活；继而发现只有层粘连蛋白（laminin）作为胞外基质时，细胞可呈现独特单层阿米巴样集落并持续增殖，其他基质均导致迅速凋亡。进一步试验显示，长期传代过程中细胞出现增殖放缓，而向DARP中添加5–20 μM胆固醇可剂量依赖地逆转这一衰退，使扩增速率与经典KSR体系相当，且不影响核型稳定。胆固醇的促增殖效应并非通过增强LIF-STAT3或 Wnt-β-catenin信号，提示其作用于尚未阐明的下游通路。DARP中培养的mESC持续高表达Oct4、Sox2、Nanog，不表达激发态标记OTX2；转录组聚类分析将其牢牢锁定在原始态集群，远离激发态EpiSC。畸胎瘤实验显示三胚层结构完整，证实其分化潜能未受损害。更关键的是，取自CAG-GFP转基因囊胚的实验表明，DARP可在有饲养层时高效建立新胚胎干细胞系，所得细胞既能转入无饲养层laminin环境长期维持，又可通过八细胞聚集法生成高比例嵌合体，并贡献包括生殖嵴在内的各组织，生殖系传递能力确凿。至此,，DARP为原始态干细胞提供了完全开放、可自由调配且功能完整的培养平台。

针对激发态干细胞，作者检验了DARP的通用性。小鼠区域选择性上胚层干细胞（rsEpiSC）代表植入后外胚层，其维持依赖FGF2与Wnt抑制。将DA-X辅以FGF2、IWR-1与β-巯基乙醇后，可支持rsEpiSC在饲养层上长期生长并保留OCT4、SOX2、OTX2表达及三胚层分化潜能。然而，同样剂量下对mESC有益的胆固醇却对rsEpiSC表现强烈毒性，提示不同pluripotency状态对胆固醇代谢需求存在根本差异。转录组层面，DA-X培养的rsEpiSC与经典N2B27体系培养的激发态细胞聚为一支，远离原始态集群，进一步验证体系保真。该发现不仅拓宽了DA-X基底液的应用范围，也首次揭示胆固醇在小鼠多能干细胞中的状态依赖性双重角色。

综上，本研究通过公开所有组分的DARP无血清培养基，为原始态与激发态小鼠多能干细胞提供了统一、可控且功能验证充分的培养方案，彻底摆脱了对商业保密添加剂和胎牛血清的依赖。胆固醇的促增殖与毒性反差更提示未来可通过精细代谢调控定向干预干细胞命运。该体系将显著提升实验重现性，降低成本，并为解析特定成分如何调控自我更新、分化及跨物种应用奠定开放框架。

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来源：10.3389/fbioe.2024.1390386