噬菌体结合基因剪刀CRISPR，实现“休眠”李斯特菌精准检测

背景

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为一种重要的食源性致病菌，不仅能在冷藏温度下生长繁殖，还可在多种环境胁迫（如低温、抗生素、氧化应激等）下进入“活而不育”（Viable but Non-Culturable, VBNC）状态。处于VBNC状态的菌体虽丧失在常规培养基上生长的能力，但仍保持代谢活性及潜在毒力，一旦环境条件适宜便可复苏并引发感染。这一特性导致传统基于培养的检测方法出现严重的假阴性结果，而现有的分子检测技术（如qPCR）虽灵敏度较高，却无法有效区分活菌与死菌，从而无法准确评估样品的实际生物风险，对食品安全监测及公共卫生防控构成持续威胁。

近年来，噬菌体因其能够特异性识别并感染活菌宿主的天然特性，已成为区分活/死菌的理想生物识别元件。与此同时，CRISPR/Cas12a系统作为一种新兴的分子诊断工具，凭借其程序化靶标识别与高效的“反式切割”信号放大能力，为低丰度核酸的快速、灵敏检测提供了强大平台。然而，如何将噬菌体的活性识别功能与CRISPR/Cas12a的高灵敏度检测优势有效耦合，构建一个能够特异性检测活菌（包括VBNC状态菌体）的集成化检测体系，仍是一个亟待解决的关键科学问题。

研究结果

1. 系统成功构建并完成关键优化。针对噬菌体vB-LmoM-NJ05基因组设计的五组crRNA及引物中，成功筛选出靶向尾丝蛋白基因的高效识别单元（图1）。该系统通过噬菌体感染活菌并释放子代进行生物扩增，再经CRISPR/Cas12a实现信号放大。关键参数的优化显示：当Cas12a与crRNA浓度由推荐初始值250 nM降至25 nM时，反应动力学更为可控，荧光曲线呈现理想的指数增长与平台期；同时，确定8小时为最佳共培养时间，此时噬菌体滴度可增长至10³ PFU/mL，且CRISPR/Cas12a系统已能产生稳定检测信号。

图1 PAA-CRISPR/Cas12a分析和条件优化

2. 检测灵敏度达到较高水平。灵敏度评估采用两种方式：一是使用含有靶标序列的重组质粒（pUC57-crRNA），经十倍梯度稀释后测试。结果表明，系统对纯DNA的检测限为4.16 × 10¹ copies/mL。在10¹至10³ copies/mL范围内，终点荧光强度与靶标浓度的对数呈现良好线性关系（y = 4895x + 7690， R² = 0.985）。二是使用活菌进行测试，该方法对纯培养状态下李斯特菌NJ05的检测限为3.1 × 10¹ CFU/mL（图2），展现了其在微生物检测中的高灵敏度。

图2 检测限

3. 方法具备高特异性与较广的宿主覆盖。特异性测试显示，该方法仅对李斯特菌标准株ATCC 13932及实验株NJ05产生显著荧光信号，而对包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等在内的七种常见食源性致病菌均无非特异性信号（图3）。进一步的宿主谱分析证实，所用噬菌体vB-LmoM-NJ05对42株受试李斯特菌中的30株（70%）具有裂解活性，覆盖了1/2a, 1/2b, 4b等与人类疾病最相关的主要致病血清型，表明该方法具备针对该病原菌的较广检测覆盖范围。

图3 PAA-CRISPR/Cas12a检测单核细胞增生李斯特氏菌的特异性

4. 成功实现对VBNC状态菌体的有效检测。为验证方法对VBNC菌的检测能力，研究使用FeSO₄诱导李斯特菌NJ05进入VBNC状态。平板计数证实其可培养性丧失，而FDA/PI荧光双染结果显示细胞膜完整且具有代谢活性（绿色荧光），证实VBNC状态诱导成功。应用本检测方法，仍能对处于VBNC状态的菌体产生明确的阳性荧光信号（图4），核心突破了传统培养方法及普通分子检测无法识别VBNC菌的局限。

图4 检测可存活但不可培养（VBNC）细菌

5. 在模拟真实样本中表现稳定。为评估实际应用潜力，研究在生菜匀浆液中进行人工添加实验。结果表明，在复杂的食品基质背景下，该方法仍能保持稳定的检测性能，对污染菌的检测灵敏度为5.0 × 10¹ CFU/mL（图5）。此结果证明了该方法在面对实际样本时，具备良好的抗基质干扰能力与可靠性。

图5 不同浓度下带刺生菜的PAA-CRISPR/Cas12a荧光强度曲线

总结与展望

本研究成功开发了一种基于噬菌体扩增与CRISPR/Cas12a联用的新技术，实现了对活性单核细胞增生李斯特菌（含VBNC状态）的高灵敏度（31 CFU/mL）、高特异性快速检测，有效突破了传统方法在活菌判别与VBNC检测中的局限。未来通过结合等温扩增、微流控芯片等技术集成优化，有望推动该方法向便携化、自动化发展，为食品中活性致病菌的现场监测与风险评估提供更实用的解决方案。

来源：https://doi.org/10.1016/j.lwt.2025.118964