无需打针的疫苗：微藻介导的口服免疫策略对抗哈维氏弧菌

背景知识

弧菌病是由哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）等病原菌引起的严重水产养殖疾病，每年造成超过10亿美元的经济损失，占马来西亚海鲈养殖生产成本的7%以上。传统疫苗接种主要依赖注射方式，存在操作繁琐、成本高昂、对鱼体造成应激、需要最小鱼体规格等局限性，难以应用于幼鱼阶段。口服疫苗虽具潜力，但商业化产品仍十分有限。微藻Nannochloropsis sp.作为“公认安全”（GRAS）的生物，具有丰富的营养价值和规模化生产潜力，此前已被用作水产饲料，但其作为疫苗递送载体的应用尚未充分开发。本研究选择OmpK作为靶抗原，因其已在石斑鱼和大黄鱼中证明具有免疫保护效果。

研究方法

研究采用多种分子生物学技术构建和验证转基因微藻。首先构建了两个同源重组载体（VCP_OMPK_ZA1和VCP_OMPK_ZA2，分别使用单向和双向VCP启动子）和一个CRISPR/Cas9载体，通过电穿孔法转化Nannochloropsis sp.，利用博来霉素抗性筛选转化子。通过PCR、RT-PCR、Western blot和点杂交等技术在基因组、转录组和蛋白质水平验证转化成功。随后开展斑马鱼喂养试验，设置三组（转基因微藻组、野生型微藻组、商业饲料对照组），进行两次免疫接种（第7天和第23天，连续5天投喂），并在第42天进行哈维氏弧菌攻毒试验（LD50剂量腹腔注射）。通过实时定量PCR检测免疫相关基因（IgZ、TNF-α、IL-1β）表达，结合组织病理学和生存率分析评估疫苗效力。

图1 口服疫苗递送系统开发原理图

研究结果

同源重组法（特别是V1转化株）比CRISPR/Cas9系统更有效，成功获得稳定表达OmpK的转基因微藻株。PCR证实表达盒整合到硝酸还原酶基因位点（预期条带3703-4208 bp），RT-PCR检测到740 bp的OmpK转录本，Western blot证实约35 kDa的OmpK蛋白表达。免疫基因表达分析显示，转基因疫苗组IgZ表达在首次免疫后第14天显著上调4倍（p<0.05），加强免疫后第29天IgZ、TNF-α和IL-1β均显著上调。攻毒试验结果令人鼓舞：转基因疫苗组96小时生存率达90%，显著高于野生型微藻组（64%）和对照组（36%），相对保护率达90%。组织病理学显示，疫苗组鱼体肝脏和肌肉组织损伤轻微，出现活跃的肌肉再生和淋巴细胞浸润，而对照组呈现严重坏死和空泡变性。

结论与意义

本研究成功证明了转基因Nannochloropsis sp.作为口服疫苗载体的可行性，为水产养殖疾病防控开辟了创新途径。该方法克服了传统注射疫苗的诸多局限，特别适合大规模幼鱼免疫，操作简便且成本效益高。研究发现野生型微藻本身也具有一定的非特异性免疫刺激作用（64%生存率），而转基因疫苗则提供特异性抗原保护，两者结合可能产生协同效应。该口服疫苗平台具有重要应用前景：可减少抗生素使用、提高养殖生产力、支持可持续水产养殖发展。未来研究需在商业化海水养殖物种（如亚洲海鲈、点带石斑鱼）中验证效果，优化免疫剂量和程序，开发多价疫苗，并进行全面的安全性评估和监管审批。这项工作为微藻生物技术和水产疫苗学的交叉领域提供了重要的概念验证和技术基础。

参考来源：Abidin AAZ, Noorhisham NIH, Md Yusoff F, Omar AR, Yusoff K, Ismail S, Khayat ME, Abd Karim MM, Md Yasin IS, Chong CM, Yusof ZNB. Enhancing vibriosis vaccination in fish: genetically modified Nannochloropsis sp. as an oral vaccine carrier. World J Microbiol Biotechnol. 2026 Mar 3;42(3):114. doi: 10.1007/s11274-026-04843-y. PMID: 41774280.