兽用耐热液体新城疫活疫苗创制：突破冷链限制的12个月稳定性研究

背景知识

新城疫（Newcastle Disease, ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，对全球家禽业构成严重威胁，可导致重大经济损失。目前，疫苗接种结合生物安全措施是防控该病的核心策略。传统的新城疫疫苗主要包括灭活疫苗和活疫苗两大类：灭活疫苗虽能诱导持久的体液免疫，但需逐只注射，操作繁琐且无法有效激发细胞免疫和黏膜免疫；而活疫苗虽可通过喷雾、饮水等途径群体免疫，操作便捷且能同时激活多重免疫应答，但传统活疫苗普遍存在热敏感性高的问题。目前市售的活疫苗多为冻干制剂，尽管冻干工艺能在一定程度上提高稳定性，但仍需在2-8℃或更低温度下冷藏运输，依赖稳定的冷链系统，这不仅增加了疫苗成本，也限制了其在偏远地区和发展中国家的应用。此外，冻干疫苗使用前需用特殊稀释剂复溶，工艺复杂且随储存时间延长效价逐渐下降。相比之下，耐热液体疫苗具有制备工艺简单、接种操作便捷、无需复溶等优势，但开发此类疫苗的关键挑战在于如何在液体环境中维持病毒的构象稳定性和感染性，防止蛋白质变性和病毒颗粒聚集。

图 耐热液体疫苗的免疫原性和保护效力评价

研究方法

本研究采用系统优化的策略开发耐热液体新城疫疫苗。首先，通过比较超纯水、0.9%生理盐水、0.01M PBS和0.01M Tris/HCl四种缓冲液体系在56℃热应激条件下对NDV血凝素滴度的保护作用，筛选出最优基础缓冲液，并进一步在pH 5.0-9.0范围内优化缓冲液pH值。在此基础上，设计了11种不同的稳定剂配方（F1-F11），系统评估明胶、脱脂奶粉、海藻糖、L-谷氨酸、维生素C和硫脲等不同组分及其浓度组合对病毒在37℃加速老化试验中稳定性的影响，通过TCID₅₀测定筛选出最优配方后，进一步对pH值（6.0-8.5）和原材料等级（食品级、工业级、分析级）进行精细化优化。随后，研究评估了6株不同NDV毒株（包括野生型LaSota、耐热TS09-C及4株通过表面电荷工程改造的重组耐热株）与最优稳定剂配方的兼容性，通过56℃水浴处理和37℃储存试验筛选出热稳定性最佳的候选毒株rTS-HN-N3。在长期稳定性评价阶段，将含稳定剂的rTS-HN-N3疫苗与不含稳定剂的对照组分别置于4℃（12个月）和25℃（60天）条件下储存，定期采样测定病毒滴度变化。最后，通过动物实验评估疫苗的免疫原性和保护效力：将60只7日龄SPF鸡随机分为6组，分别免疫新鲜配制的含稳定剂疫苗、4℃储存12个月的含稳定剂疫苗、相应的不含稳定剂对照疫苗及商业LaSota疫苗，在免疫后第7、14、21天采集血清进行血凝抑制（HI）试验检测抗体水平，并于第21天用强毒株F48E9进行攻毒，观察8天内的临床表现和存活率。

研究结果

研究首先确定0.01M Tris/HCl缓冲液（pH 7.0-7.5）为最优基础体系，该条件下病毒在56℃处理90分钟后血凝素滴度仅下降约1.0 log₂，显著优于其他缓冲液。通过稳定剂筛选，确定配方F11（含0.5%明胶、4%海藻糖、0.1% L-谷氨酸和0.5%硫脲）表现最佳，在37℃储存7天后病毒滴度仅损失约0.5 log₁₀ TCID₅₀，而无稳定剂组损失达3.5 log₁₀；且该配方使用食品级、工业级或分析级原料效果无显著差异。毒株筛选显示，重组耐热株rTS-HN-N3具有最优的热稳定性，在56℃处理90分钟后血凝素滴度几乎无变化，且与F11稳定剂联合使用时，在37℃储存7天仅损失0.2 log₁₀ TCID₅₀。长期稳定性试验表明，含稳定剂的rTS-HN-N3疫苗在4℃储存12个月期间滴度仅下降0.25 log₁₀，前6个月几乎保持稳定；在25℃条件下可稳定保存30天，60天滴度损失为1.3 log₁₀，而无稳定剂对照组在相同条件下分别损失3.75 log₁₀（4℃，12个月）和3.5 log₁₀（25℃，60天）。动物实验结果显示，含稳定剂的疫苗在储存12个月后仍能诱导高水平的NDV特异性抗体（21天HI滴度约24.5），与新鲜制备疫苗及商业疫苗相当；攻毒保护试验中，免疫含稳定剂疫苗（无论新鲜或储存12个月）的鸡群均获得100%保护，而无稳定剂储存疫苗的保护率仅为60%，未免疫对照组全部死亡。

结论与意义

本研究成功开发了一种基于Tris/HCl缓冲体系和复合稳定剂配方（F11）的耐热液体新城疫活疫苗，通过整合内在耐热毒株（rTS-HN-N3）的遗传特性与外在稳定剂的保护作用，实现了疫苗在4℃条件下12个月和25℃条件下30天的稳定储存，且保持良好的免疫原性和保护效力。该研究不仅为新城疫的防控提供了一种无需冷冻干燥、可部分脱离冷链的新型疫苗选择，降低了疫苗的生产、运输和储存成本，特别有利于资源有限的地区开展大规模免疫接种，而且建立的技术平台（耐热NDV载体与液体稳定剂体系）为开发针对其他禽类病原体的多价耐热液体疫苗奠定了理论基础。此外，研究证实食品级原料即可满足稳定剂要求，为疫苗的产业化生产提供了经济可行的方案。尽管该疫苗在25℃下的稳定性仍有提升空间，但其成果标志着在解决兽医生物制品冷链依赖方面取得了重要突破，为下一代兽用疫苗的理性设计提供了重要参考。

参考来源：Li, L.; Xu, Y.; Yang, J.; Feng, H.; Wang, H.; Zeng, Z.; Yao, L.; Luo, Q.; Wen, G.; Cheng, G.; et al. Development and Characterization of a Thermostable Liquid Formulation of Live Newcastle Disease Vaccine. Vet. Sci. 2026, 13, 359. https://doi.org/10.3390/vetsci13040359.