告别胎牛血清！新型无血清培养基让实验室培育"真肉块"成为现实

本研究成功开发了一种适用于肌母细胞长期扩增及三维培养的无血清培养基，并以小鼠C2C12肌母细胞为模型验证了其在细胞培养肉生产中的应用潜力。通过系统的配方筛选与优化，最终获得的无血清培养基配方（OPT13）不仅能够支持肌母细胞的短期高效增殖，更能维持其长期传代能力及肌源性分化潜能，其性能与含10%胎牛血清的传统生长培养基相当，为细胞培养肉的大规模生产提供了重要的技术支撑。

在培养基开发过程中，研究从基础无血清配方出发，针对肌母细胞贴壁、增殖和传代的关键需求，筛选了包括脂质浓缩物、重组转铁蛋白、表皮生长因子、非必需氨基酸、地塞米松、胰岛素、孕酮、棕榈酰三肽-5、丝胶蛋白、叶酸、生物素、维生素E、酵母提取物、丙酮酸钠、Hepes、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和乙二胺在内的19种潜在活性成分。通过因子效应分析，确定丙酮酸钠、丝胶蛋白和β-巯基乙醇为显著负效应因子，而地塞米松、胰岛素、棕榈酰三肽-5、叶酸、生物素、维生素E、Hepes、L-谷氨酰胺和乙二胺等组分显示出促进细胞增殖的潜力。基于这些筛选结果构建的优化培养基（OPT13）在短期培养中表现出优异的细胞支持能力，其相对细胞密度可达含血清培养基的88%，显著优于其他筛选配方。

在长期传代性能评估中，OPT13展现出稳健的细胞支持能力。经过连续传代培养，使用该培养基的肌母细胞保持典型的纺锤形形态，增殖倍增时间稳定在28.26小时，比生长速率达0.025 h⁻¹，累积群体倍增水平在第六代时达到16.66，与含血清培养基培养效果相当。尤为重要的是，经过五代传代后，肌母细胞在OPT13中的凋亡率仅为4.23%，显著低于含血清培养基对照组，表明该无血清配方不仅能有效维持细胞活力，还能降低细胞应激反应。相比之下，其他优化配方（如OPT1和OPT3）在长期培养中表现出明显的性能衰减，细胞逐渐伸长变形，增殖能力随传代次数增加而显著下降，最终在第六代左右丧失继续传代的能力。

肌源性分化潜能的维持是评价无血清培养基适用性的关键指标。研究通过免疫荧光染色检测肌球蛋白重链（MHC）表达及肌管形成能力，验证了不同培养条件下肌母细胞的分化性能。结果显示，在OPT13中长期培养的肌母细胞经诱导分化后，能够形成大量粗长、多核的MHC阳性肌管，其形态和数量与含血清培养基培养的细胞相当，明显优于其他无血清配方组。这一结果表明OPT13不仅能支持肌母细胞的持续增殖，更能完整保留其向成熟肌肉细胞分化的能力，这对于后续细胞培养肉的生产至关重要。

基于确立的无血清培养体系，研究进一步建立了微载体悬浮培养系统以实现大规模细胞扩增。选用可食用的多孔明胶微载体（Cultispher S）作为细胞附着基质，在搅拌式生物反应器中进行培养。实验设置了三组对比：全程使用含血清培养基（GM组）、前12小时使用含血清培养基后转为无血清培养基（GM+SFM组）以及全程使用无血清培养基（SFM组）。结果显示，虽然无血清条件下细胞在微载体上的初始贴附率显著低于含血清条件，但其在后续增殖阶段表现出强劲的扩增能力。经过7天培养，SFM组的实际最大扩增倍数达到43.55倍，显著高于GM组（26.80倍）和GM+SFM组（21.81倍）。尽管SFM组的最大细胞密度（53.80×10⁴ cells/mL）低于GM组（97.80×10⁴ cells/mL），但其基于实际贴附细胞计算的高效扩增能力表明，无血清培养基在微载体系统中具有优异的细胞增殖促进效果。

在微载体上培养的肌母细胞保持良好的活力，活/死细胞染色显示细胞在培养过程中维持高活性状态。扫描电镜观察证实细胞能够有效贴附于微载体表面并增殖，形成致密的细胞层。更重要的是，这些在微载体上扩增的肌母细胞在诱导分化后仍能形成MHC阳性的多核肌管，证明三维培养环境结合无血清培养基并未损害细胞的分化潜能。

研究最后探索了利用无血清培养体系获得的细胞-微载体复合物制备细胞培养肉块的可行性。收集培养14天后的细胞-微载体混合物，经PBS清洗后添加食品级谷氨酰胺转氨酶进行交联，在37°C条件下过夜反应形成稳定的块状结构。随后使用甜菜红和β-胡萝卜素进行着色，获得外观呈鲜红色的块状培养肉产品。免疫荧光染色分析显示，交联后的细胞培养肉块中仍可见MHC阳性的肌管结构，F-肌动蛋白染色显示细胞骨架结构完整，证实该制备工艺能够维持细胞的基本组织结构特征。

该无血清培养基的核心优势在于其成分明确且成本可控，不含层粘连蛋白、多种生长因子或商业血清替代物等昂贵组分，主要依赖基础培养基提供的营养支持，辅以维生素C、维生素E、叶酸、生物素等维生素类成分，以及具有促进胶原合成和细胞外基质生成作用的棕榈酰三肽-5。其中，维生素C不仅支持细胞存活，更对成纤维细胞产生胶原以维持培养肉结构完整性具有重要作用；维生素E作为强效抗氧化剂，在无血清条件下能有效保护肌细胞免受氧化应激损伤；叶酸和生物素分别参与核酸蛋白合成和脂肪酸代谢，为细胞增殖提供必要的代谢支持。

然而，该研究也揭示了无血清培养体系在微载体应用中面临的挑战，主要体现在细胞初始贴附阶段效率较低。这提示未来需要进一步优化培养基配方以增强细胞贴附能力，或开发具有更适合表面特性的可食用微载体材料。此外，虽然C2C12细胞作为模型系统验证了无血清培养概念的可行性，但未来仍需在牛、猪等食用动物的初级肌卫星细胞或永生化细胞系中验证该培养基的适用性，并针对物种特异性差异进行配方调整，以推动其在实际细胞培养肉生产中的应用。

国内生物科技企业广东环凯生物科技有限公司也已开发出适用于兽用疫苗生产的无血清培养基系列产品，为兽用生物制品的无血清工艺国产化提供了重要支撑。

来源：10.1111/1750-3841.16884